神經(jīng)元是完成大腦功能的基本組件，因此要想了解大腦是如何工作的，又是如何出現(xiàn)功能異常的，都需從研究神經(jīng)元的形態(tài)、功能入手。免疫組化技術(shù)已經(jīng)成為神經(jīng)科學(xué)工作者必不可少、也是最有價(jià)值的研究工具之一。利用各種細(xì)胞組分的抗體，研究者能夠?qū)⑸窠?jīng)元和其他類型腦細(xì)胞區(qū)分開來，同時(shí)可根據(jù)細(xì)胞形態(tài)特征和特定蛋白表達(dá)獲取感興趣的信息。而在研究神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)分化及神經(jīng)再生領(lǐng)域，未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物�？蓸�(biāo)記出那些不同發(fā)育階段的新生神經(jīng)元，也是該領(lǐng)域研究常用的標(biāo)記工具。本文綜述了常用的神經(jīng)元標(biāo)記物和未成熟神經(jīng)元的標(biāo)記物的研究進(jìn)展。

1 骨細(xì)胞的力學(xué)調(diào)控概述

1.1 神經(jīng)元核抗原

神經(jīng)元核抗原(neuron specific nuclear protein，NeuN)是一種可溶性核蛋白，1992 年，Mullen 等報(bào)道了能夠識別脊椎動物神經(jīng)元特異的核蛋白單克隆抗體的產(chǎn)生，該蛋白被稱為NeuN，分子量多為46~48 kD，在體外能與DNA 結(jié)合，已成為周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)成熟神經(jīng)元的常用標(biāo)志物。在大鼠，NeuN 廣泛表達(dá)，大部分神經(jīng)元(大腦皮質(zhì)、基底核、脊髓背角等)有明顯表達(dá);部分神經(jīng)元為中等表達(dá)(三叉神經(jīng)脊束核、下丘腦室旁核等);部分神經(jīng)元為弱表達(dá)(孤束核、藍(lán)斑等);而有些核團(tuán)神經(jīng)元缺乏NeuN 的表達(dá)(視上核、弓狀核、迷走神經(jīng)背核等)。在成年小鼠，NeuN 表達(dá)見于小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的大部分神經(jīng)細(xì)胞，原代培養(yǎng)的小腦細(xì)胞中亦可檢測到NeuN，但在小腦Purkinje 細(xì)胞、嗅球僧帽細(xì)胞以及視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞未見表達(dá)。盡管NeuN 的免疫組化檢測已經(jīng)被廣泛使用，其功能最近才被了解清楚。研究人員現(xiàn)在已經(jīng)能夠?qū)�NeuN 鑒定為Fox-3，F(xiàn)ox-3 蛋白質(zhì)參與調(diào)控的mRNA 剪接。由于Fox-3 由神經(jīng)系統(tǒng)特異性表達(dá)，人們發(fā)現(xiàn)它在調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞分化和神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮作用。

1.2 神經(jīng)元特異性烯醇化酶

神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron- specificenolase，NSE)是一種γ型烯醇化酶，由Moore 等于1965 年研究神經(jīng)系統(tǒng)特異蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)[5]，是由成熟神經(jīng)元和神經(jīng)元起源細(xì)胞持續(xù)表達(dá)的胞質(zhì)蛋白，是參與糖酵解途徑的烯醇化酶中的一種，在細(xì)胞內(nèi)能量代謝中起著重要的作用。在發(fā)育過程中，NSE 的水平非常低，但在神經(jīng)元形態(tài)和功能成熟過程中增加。雖然NSE 作為神經(jīng)元標(biāo)記物得到廣泛應(yīng)用，但需要注意的是，它已被證明在特定條件下在少突膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)，并且在少突膠質(zhì)細(xì)胞分化過程中其表達(dá)增加，細(xì)胞成熟后受到抑制。在病理情況下，神經(jīng)膠質(zhì)腫瘤和反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞中也能檢測到NSE。近年來，NSE 作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤標(biāo)志物以及神經(jīng)元損傷標(biāo)志物，被國內(nèi)外關(guān)注和研究。臨床上NSE 還用于小細(xì)胞肺癌和神經(jīng)母細(xì)胞瘤診斷及評價(jià)腦損傷程度及治療效果。

1.3 微管相關(guān)蛋白

2微管相關(guān)蛋白2(microtubule associated protein-2，MAP-2)是一種熱穩(wěn)定的磷蛋白，屬于結(jié)構(gòu)性微管相關(guān)蛋白家族，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元胞體和樹突表達(dá)。MAP-2 與微管連接促進(jìn)微管的穩(wěn)定，可能參與神經(jīng)元發(fā)育、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、突起形成和突觸可塑性調(diào)節(jié)。

MAP-2 主要存在于神經(jīng)元胞體和樹突，是腦內(nèi)最豐富的蛋白之一。MAP-2b 存在于神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的整個(gè)時(shí)期，而MAP-2a 是成年特異性蛋白，在大鼠出生后2 周才開始表達(dá)。MAP-2c 在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期表達(dá)，成年后消失，但在某些部位如視網(wǎng)膜和嗅球在成年后仍然表達(dá)，可能與這些部位成年后神經(jīng)元生長和可塑性能力有關(guān)。MAP-2d 在大鼠生后5 d 才能檢測到，主要在成年神經(jīng)元胞體表達(dá)。而MAP-2e 短暫地表達(dá)在髓鞘化和多發(fā)性硬化癥損害髓鞘再生時(shí)的少突膠質(zhì)細(xì)胞。

1.4 Tau蛋白

Tau 蛋白(tau proteins)是含量最高的微管相關(guān)蛋白。正常腦中Tau 蛋白的細(xì)胞功能是與微管蛋白結(jié)合促進(jìn)其聚合形成微管;與形成的微管結(jié)合，維持微管穩(wěn)定性，降低微管蛋白分子的解離，并誘導(dǎo)微管成束。Tau 蛋白基因位于17 染色體長臂。正常人中由于Tau 蛋白mRNA 剪輯方式不同，可表達(dá)出6種同功異構(gòu)體。Tau 蛋白的多種蛋白異構(gòu)體是由單個(gè)基因，即人類基因組中為微管相關(guān)蛋白tau(microtubule-associated protein tau，MAPT)mRNA 的選擇性剪接而形成的。1975 年，它們由MarcKirschner 在普林斯頓大學(xué)的實(shí)驗(yàn)室中發(fā)現(xiàn)。Tau蛋白通過異構(gòu)和磷酸化控制微管的穩(wěn)定性。Tau 蛋白在神經(jīng)元中含量非常豐富，而少見于其它細(xì)胞，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中也有低表達(dá)。Tau 蛋白主要定位于軸突的遠(yuǎn)端部分，而在樹突中不存在。

1.5 微管蛋白

微管蛋白(tubulin)是細(xì)胞內(nèi)微管的基本結(jié)構(gòu)單位。微管蛋白是一類含有多個(gè)成員的蛋白質(zhì)家族，微管由α-微管蛋白和β-微管蛋白所形成的二聚體為單位聚集而成，兩者可以組成一種穩(wěn)定的存在形式，在細(xì)胞的運(yùn)動和分裂中都發(fā)揮著重要作用。此外，還有γ、δ和ε微管蛋白。ε-微管蛋白位于中心粒周圍，其定位是通過細(xì)胞周期調(diào)控的。在細(xì)胞周期的早期階段，蛋白質(zhì)主要與舊中心體相關(guān)，僅在晚期它才與舊的和新的中心體均相關(guān)。γ-微管蛋白(48 kDa)在真核細(xì)胞中微管組織中心(MTOCs)中，是一種廣泛存在且高度保守的蛋白質(zhì)。γ-微管蛋白與微管負(fù)端結(jié)合，負(fù)責(zé)介導(dǎo)微管和中心體之間的聯(lián)系。γ-微管蛋白豐度小于1%的α-或β-微管蛋白的水平。

1.6 神經(jīng)絲

神經(jīng)絲(neurofilament，NF)是神經(jīng)元細(xì)胞骨架蛋白，定位于軸突，為軸突提供結(jié)構(gòu)支持并調(diào)節(jié)軸突的直徑。通常是指在成熟的神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)組成10nm 纖維的NF-L，NF-M 和NF-H 三種蛋白亞基，稱為NF 蛋白三組分。在神經(jīng)突起中，NF 沿其縱向平行排列成束，并且在NF 之間還有一些長短不一的橫橋相連。

2 未成熟神經(jīng)元標(biāo)記物

2.1 雙皮質(zhì)醇

雙皮質(zhì)醇(Doublecortion，DCX)是一種編碼微管相關(guān)蛋白，可直接使純化后的微管蛋白Tubulin 聚合成微管。在神經(jīng)元遷移中，DCX 控制起始過程的聚合作用，穩(wěn)定細(xì)胞骨架，在新神經(jīng)元最終定位中起重要作用。孕鼠、新生鼠和成年鼠腦中均表明DCX在成熟神經(jīng)元中無表達(dá)，DCX 在干細(xì)胞中有表達(dá)，但在神經(jīng)元前體細(xì)胞階段的表達(dá)是較高的。因此，可以根據(jù)DCX 表達(dá)水平來分離出神經(jīng)元前體細(xì)胞。DCX 作為研究神經(jīng)元遷移，分化，再生的標(biāo)記物，通過對其表達(dá)的研究可使我們了解神經(jīng)元的分化和再生，以及在發(fā)育中的意義。

2.2 ßIII微管蛋白

ßIII 微管蛋白(beta III Tubulin，TuJ1)是一種參與神經(jīng)元細(xì)胞類型特異性分化的微管蛋白。微管蛋白是微管的主要結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞骨架的組成成分，在細(xì)胞結(jié)構(gòu)的維護(hù)，有絲分裂，減數(shù)分裂，細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸?shù)鹊确矫姘l(fā)揮作用。因此，免疫組化染色發(fā)現(xiàn)TuJ1 存在于未成熟的神經(jīng)元胞體，樹突，軸突和軸突末端。使用免疫組化檢測TuJ1 的顯著優(yōu)點(diǎn)之一是其展現(xiàn)軸突和末端細(xì)節(jié)的能力。事實(shí)上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它在檢測細(xì)胞骨架元件受損后的變化中是有用的。雖然某種β-微管蛋白的結(jié)構(gòu)在膠質(zhì)細(xì)胞中也有發(fā)現(xiàn)，但它卻并不能被TuJ1抗體識別。

2.3 神經(jīng)分化因子1

神經(jīng)分化因子1(neuronal differentiation 1，NeuroD-1)又名B 細(xì)胞E 盒轉(zhuǎn)錄激活因子2(Beta-2)，是一種bHLH 蛋白。作為轉(zhuǎn)錄因子，NeuroD-1通過與靶基因的特異序列結(jié)合參與生物發(fā)育過程，調(diào)節(jié)與機(jī)體各部分正常發(fā)育或細(xì)胞正常分化的有關(guān)基因的表達(dá)。近來發(fā)現(xiàn)NeuroD-1 基因突變與糖尿病有關(guān)。NeuroD-1 定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，表達(dá)于不成熟的神經(jīng)元中，參與神經(jīng)系統(tǒng)分化;是后生微神經(jīng)正確分化所必需的，其缺失會導(dǎo)致細(xì)胞死亡。NeuroD 正是作為神經(jīng)分化因子，高表達(dá)于周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)育中的神經(jīng)元。在大腦皮質(zhì)和脊髓中，在細(xì)胞處于分化期Neuro D mRNA 高表達(dá)，而當(dāng)神經(jīng)元成熟后表達(dá)減少。而人類和小鼠小腦和海馬，NeuroD mRNA 表達(dá)在整個(gè)成年期都維持在高水平，這表明NeuroD 在這些組織中持續(xù)發(fā)揮作用。

3 結(jié)語

恰當(dāng)?shù)纳窠?jīng)元標(biāo)記物的選擇取決于研究者某一特定的研究目標(biāo)。如果首要目標(biāo)是確定是否為神經(jīng)細(xì)胞，則可用到如NeuN 和MAP-2 標(biāo)記。這兩種神經(jīng)元標(biāo)記的抗體已被廣泛使用，而且其標(biāo)記特性和分布特征已經(jīng)有了較明確的研究結(jié)果。雖然這兩個(gè)標(biāo)記物均可用于評估神經(jīng)元總數(shù)或神經(jīng)元密度的研究中，但NeuN 屬于緊湊的核染色模式，而MAP-2 為分散的樹突標(biāo)記，因此NeuN 更適合于計(jì)數(shù)研究，更有利于足夠量的數(shù)據(jù)收集。此外，由于細(xì)胞計(jì)數(shù)的應(yīng)用，由緊湊模式帶來的高對比度(即信噪比)也是有對結(jié)果分析有利的。

在神經(jīng)再生研究中，通常涉及聯(lián)合標(biāo)記細(xì)胞，檢測細(xì)胞增殖，如溴脫氧尿苷或氚標(biāo)記胸苷，聯(lián)合神經(jīng)元表型標(biāo)記。此外，根據(jù)細(xì)胞分裂的不同階段，這些研究一般需要那種在細(xì)胞周期中某一特定時(shí)間段表達(dá)的標(biāo)記物。因?yàn)榈鞍椎谋磉_(dá)在不同的細(xì)胞分化的階段而有所差別，標(biāo)記物的選擇將顯著影響對于新生神經(jīng)元的計(jì)數(shù)。有時(shí)，一項(xiàng)研究可能涉及對某一特定類型的神經(jīng)元進(jìn)行細(xì)分。例如，根據(jù)某一特定的神經(jīng)遞質(zhì)對神經(jīng)元作進(jìn)一步區(qū)分時(shí)，神經(jīng)遞質(zhì)受體或神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)生的相關(guān)酶的抗體就可能被使用到。其中包括一些標(biāo)記谷氨酸能的，GABA 能的，膽堿能的或者單胺能的神經(jīng)元，這也是極為重要的一類神經(jīng)元標(biāo)記物，這部分在本綜述中沒有涉及。