放射性肺損傷(radiation- induced lung injury，RILI)是胸部放療中常見(jiàn)的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量以及預(yù)后。而目前在臨床上仍缺少有效的醫(yī)治手段和方法。近年來(lái)大量研究發(fā)現(xiàn)，間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可通過(guò)分化替代、旁分泌、免疫調(diào)節(jié)等方式，減輕或治療放射性肺損傷。但隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)外源性MSCs移植到肺臟損傷部位數(shù)量較少，這在一定程度上影響了MSCs 更好的發(fā)揮其生物學(xué)作用。而在關(guān)于MSCs 的體外試驗(yàn)及其他器官疾病的研究中，發(fā)現(xiàn)在體外給予MSCs 刺激、誘導(dǎo)，或通過(guò)基因轉(zhuǎn)染等方法，提高M(jìn)SCs 上CXCR4 基因的表達(dá)后，可增強(qiáng)其向受損傷組織部位的歸巢，從而達(dá)到提升治療效果的作用。因此，本研究擬通過(guò)體外的transwell 試驗(yàn)，觀察經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，過(guò)表達(dá)CXCR4 基因的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cordsmesenchymal stem cells，HUMSCs)是否可提高趨化、遷移能力，為進(jìn)行后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供一定的理論基礎(chǔ)，從而解決輸注MSCs 到肺損傷局部數(shù)量較少的問(wèn)題，達(dá)到提升MSCs 減輕放射性肺損傷的治療效果。

1 材料和方法

1.1 一般材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源新生兒臍帶來(lái)源于海軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科，經(jīng)產(chǎn)婦簽定知情同意書后，無(wú)菌條件下留取剖宮產(chǎn)的足月健康新生兒臍帶。參考以往研究報(bào)道，通過(guò)組織塊貼壁法分離和培養(yǎng)HUMSCs，并已對(duì)其進(jìn)行分化檢測(cè)及流式細(xì)胞儀檢測(cè)其免疫表型，符合MSCs 標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 試劑DMEM/F12(dulbecco's modified Eagle'smedium/F12)培養(yǎng)基，青霉素，鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司;胰蛋白酶(Trypsin)購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司;胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司;Transwell 小室(8 μm，24 孔)購(gòu)自美國(guó)Corning 公司;SDF- 1 趨化因子，購(gòu)自美國(guó)SAB 公司(801121);兔多克隆抗-CXCR4 抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司(BA0761);Dylinght549 熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Abbkine 公司(A23320);GAPDH 兔克隆一抗購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司(ab9485);HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗購(gòu)自普利萊生物技術(shù)公司(C1309)。

1.1.3 病毒構(gòu)建CXCR4 慢病毒載體和陰性對(duì)照組慢病毒載體由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司協(xié)助構(gòu)建。CXCR4 基因來(lái)源人類，GENE ID 為7852，Genebank 編號(hào)為NM_001008540。載體為GV287，分子量為10.4 kb，元件順序?yàn)椋篣bi-MCS-3FLAGSV40-EGFP。

1.2 方法

1.2.1 慢病毒載體轉(zhuǎn)染病毒轉(zhuǎn)染前2 h，將第3 代HUMSCs 的各個(gè)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液更換為DMEM/F12培養(yǎng)液，使細(xì)胞停止分裂，2 h 后更換培養(yǎng)液為HUMSCs 完全培養(yǎng)液，液量減半。加入聚凝胺，每瓶?jī)?nèi)終濃度達(dá)到6 μg/ml。參考以往研究及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選定MOI 值，按照CXCR4 慢病毒的MOI 為20，對(duì)照組慢病毒為10;即CXCR4 慢病毒需1×107 TU，對(duì)照組慢病毒需5×106 TU，分別加入后混勻。12 h后吸出含慢病毒的培養(yǎng)液，更換為新鮮培養(yǎng)液。自慢病毒轉(zhuǎn)染72 h 后，通過(guò)熒光顯微鏡，觀察HUMSCs表達(dá)EGFP 熒光情況并拍照。

1.2.2 免疫熒光檢測(cè)將正常HUMSCs 組(Normal-HUMSCs)、轉(zhuǎn)染CXCR4 的HUMSCs 試驗(yàn)組(CXCR4-HUMSCs)和對(duì)照組(Control-HUMSCs，僅轉(zhuǎn)染EGFP的HUMSCs)接種于直徑24 mm 的圓形細(xì)胞爬片，放置于6 孔板內(nèi)，加入HUMSCs 完全培養(yǎng)液，于細(xì)胞培養(yǎng)箱，在37℃、5%CO2、飽和濕度條件培養(yǎng)。1 d 后觀察各組HUMSCs 貼壁生長(zhǎng)，移除培養(yǎng)液，PBS 輕輕沖洗后，加入約2 ml 的多聚甲醛固定6 h。加入正常血清封閉液，室溫下孵育30 min，移除血清。滴加稀釋的兔多克隆抗-CXCR4一抗抗體(1:200)，4℃避光孵育過(guò)夜。PBS 輕輕沖洗，5 min/次×2 次，滴加稀釋Dylight549 熒光二抗(1:100)，室溫孵育60 min。PBS沖洗，5 min/次×2 次，用含DAPI 甘油封片劑封片。通過(guò)激光共聚焦顯微鏡，觀察HUMSCs 熒光表達(dá)情況，EGFP 陽(yáng)性為綠色熒光，CXCR4 陽(yáng)性反應(yīng)的熒光為紅色。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染HUMSCs 后CXCR4 蛋白表達(dá)根據(jù)蛋白提取試劑盒說(shuō)明，提取CXCR4-HUMSCs 組、Control-HUMSCs 組和Normal-HUMSCs 組的細(xì)胞總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。樣本95℃變性3 min，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠，穩(wěn)壓100 v電泳分離HUMSCs 蛋白樣品。轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜后，用濃度為5%的脫脂奶粉封閉1 h，1×TBST 清洗10 min，重復(fù)3 次。分別加入兔抗-CXCR4(1:100)，兔抗-GAPDH(1:2 500)一抗后，4℃孵育過(guò)夜。緩沖劑洗膜5 次，清洗掉一抗后，加入HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG 二抗抗體(1:1 000)孵育30 min。用緩沖液清洗膜后，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑孵育顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像。通過(guò)Gel-Pro analyzer4.0 軟件，分析各組的條帶相對(duì)密度。

1.2.4 過(guò)表達(dá)CXCR4 的HUMSCs 的transwell 趨化試驗(yàn)在8 μm，24 孔transwell 小室(corning 公司)的下室，分別加入600 μl 含SDF-1濃度0 ng/ml，100 ng/ml的DMEM/F12 細(xì)胞完全培養(yǎng)液;transwell 上室分別接種CXCR4- HUMSCs 組、Control- HUMSCs 組和Normal-HUMSCs 組的HUMSCs 細(xì)胞懸液100 μl，細(xì)胞密度1×105/ml。將24 孔transwell 小室放置到細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)內(nèi)孵育12 h。剪切transwell上室底面的聚碳酯膜，去除膜向上一側(cè)未能遷移HUMSCs，PBS 洗滌，重復(fù)3 次，避免觸及膜的下層，加入多聚甲醛(濃度40 g/L)固定15 min。滴加蘇木精染色，10 min 后用PBS 輕輕沖洗聚碳酯膜，洗去染料。光鏡下(×200)統(tǒng)計(jì)遷移到小室膜向下一側(cè)的HUMSCs 數(shù)量，隨機(jī)抽取5 個(gè)視野的均數(shù)作為遷移的HUMSCs 數(shù)量進(jìn)行分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)結(jié)果用(x±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HUMSCs形態(tài)學(xué)觀察

對(duì)臍帶組織塊進(jìn)行培養(yǎng)7～10 d 后，通過(guò)顯微鏡觀察，可見(jiàn)有少量HUMSCs 沿貼壁的組織塊周邊長(zhǎng)出，形態(tài)呈梭形或多角形。大約21 d 后，HUMSCs 數(shù)量增長(zhǎng)加快，逐漸表現(xiàn)為集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞表現(xiàn)為較為均一的梭形形狀，HUMSCs 平行排列，呈旋渦狀生長(zhǎng)。

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染后HUMSCs的EGFP熒光表達(dá)

第3 代HUMSCs 在經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染第72 小時(shí)后，通過(guò)熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)HUMSCs 發(fā)出綠色熒光，并且熒光的強(qiáng)度隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，逐步增強(qiáng)。在病毒轉(zhuǎn)染后的第96 小時(shí)，可觀察到目的基因組HUMSCs 與對(duì)照組HUMSCs 發(fā)出綠色的熒光，通過(guò)與光鏡下對(duì)照，隨機(jī)觀察不同視野拍照比較，慢病毒轉(zhuǎn)染率大于80%。同時(shí)慢病毒轉(zhuǎn)染后的HUMSCs 在正常傳代之后，仍可觀察到明顯的綠色熒光。

2.3 免疫熒光檢測(cè)HUMSCs中CXCR4表達(dá)

通過(guò)激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，目的基因組HUMSCs 可見(jiàn)EGFP 標(biāo)記所發(fā)出的綠色熒光，同時(shí)可見(jiàn)經(jīng)紅色熒光標(biāo)記的CXCR4 蛋白表達(dá);對(duì)照組HUMSCs 可觀察到EGFP 標(biāo)記所發(fā)出的綠色熒光，而未見(jiàn)表達(dá)代表CXCR4 的紅色熒光;正常組HUMSCs 未見(jiàn)EGFP 綠色與CXCR4 紅色熒光表達(dá)。

2.4 Western blotting檢測(cè)慢病毒轉(zhuǎn)染后HUMSCs中CXCR4蛋白表達(dá)

Western blotting 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，CXCR4-HUMSCs 組細(xì)胞中CXCR4 蛋白呈高表達(dá)。在檢測(cè)時(shí)未能明顯區(qū)分出CXCR4-HUMSCs 組細(xì)胞中外源性CXCR4 蛋白條帶與內(nèi)源性CXCR4 蛋白表達(dá)條帶，這可能與目的基因轉(zhuǎn)染所攜帶的Flag 標(biāo)簽蛋白分子量較小，在聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)不易分離有關(guān)。但過(guò)表達(dá)CXCR4 組條帶增粗明顯，密度明顯增加，明顯高于Control- HUMSCs 組和Normal-HUMSCs 組。

2.5 Transwell趨化試驗(yàn)

通過(guò)倒置顯微鏡觀察transwell 小室上室聚碳酯膜背面，可見(jiàn)經(jīng)蘇木精染色藍(lán)紫色標(biāo)記的HUMSCs。在未加入SDF-1 的各組內(nèi)，通過(guò)隨機(jī)觀察5 個(gè)視野，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(平均每個(gè)視野細(xì)胞個(gè)數(shù)，Normal：38±5;Control：41±6;CXCR4-HUMSCs：43±4;F=1.2338，P=0.3256)。在加入SDF- 1 后，發(fā)現(xiàn)各組HUMSCs 數(shù)目較未加入SDF- 1 明顯增多，同時(shí)經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染目的基因CXCR4 組的細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組和正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(平均每個(gè)視野細(xì)胞個(gè)數(shù)，Normal：48±5;Control 50±8;CXCR4-HUMSCs：80±7;F=34.9275，P=0.0000)。

3 討論

因MSCs 具有免疫調(diào)節(jié)、修復(fù)損傷的功能和作用，已引起越來(lái)越多的矚目和關(guān)注。目前仍有多種慢性和進(jìn)展的肺部疾病，缺少有效的治療方法，而通過(guò)靜脈輸注的干細(xì)胞，可通過(guò)靜脈系統(tǒng)直接到達(dá)肺部組織，這使肺臟成為臨床使用MSCs 治療疾病的一個(gè)理想器官和部位。通過(guò)靜脈系統(tǒng)輸注MSCs 后，MSCs 可向受損傷組織部位歸巢，通過(guò)替代受損傷的細(xì)胞，旁分泌多種細(xì)胞因子，作為輸送藥物和受損部位所需介質(zhì)的載體，在治療肺部疾病中發(fā)揮巨大的作用。而隨著MSCs 治療肺損傷的研究深入，發(fā)現(xiàn)輸注的外源性MSCs 植入到肺損傷局部病灶的細(xì)胞數(shù)量較少，使MSCs 轉(zhuǎn)化數(shù)量和水平將受到限制，認(rèn)為病灶局部稀少的MSCs 密度，在治療肺纖維化上可行性不足。XUE 等的研究中發(fā)現(xiàn)，僅0.1%的肺細(xì)胞來(lái)源于植入的MSCs。因此如何提高外源性MSCs 在肺損傷局部的趨化、歸巢，增加局部的細(xì)胞數(shù)量，是干細(xì)胞治療肺損傷研究中需要解決的問(wèn)題之一。

MSCs 歸巢這一特性，使其可向受損傷的局部組織遷移，并發(fā)揮修復(fù)的作用。當(dāng)炎癥或組織受到損傷后，損傷局部可分泌大量細(xì)胞因子，MSCs 受到這些細(xì)胞因子的作用，可向受損組織的局部趨化、遷移，增加其在受損組織局部的數(shù)量分布。有研究發(fā)現(xiàn)，CXCR4/SDF- 1 生物軸在介導(dǎo)外源性MSCs 向受損傷組織局部的趨化性遷移過(guò)程中，發(fā)揮了重要作用，同時(shí)在體外試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)多種細(xì)胞因子的組合，刺激MSCs，可提高M(jìn)SCs 細(xì)胞膜上表達(dá)CXCR4，促進(jìn)這些MSCs 歸巢能力。SDF-1 可在多個(gè)器官中持續(xù)表達(dá)，而CXCR4 是這一趨化因子的特異性受體。在多種成體干細(xì)胞的表面發(fā)現(xiàn)有CXCR4 表達(dá)，體外試驗(yàn)中，隨著SDF-1 的濃度梯度增加，MSCs 遷移的能力同時(shí)增加。

目前已經(jīng)在成骨不全、移植物抗宿主病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染CXCR4，使MSCs 過(guò)表達(dá)該基因，可以改善MSCs 的歸巢，增強(qiáng)療效。因此我們擬利用慢病毒作為載體，轉(zhuǎn)染CXCR4 基因，使其在HUMSCs上過(guò)表達(dá)，以通過(guò)SDF-1/CXCR4 生物軸作用，增強(qiáng)HUMSCs 向放射線照射后肺損傷局部歸巢的能力。本研究中在進(jìn)行目的基因轉(zhuǎn)染同時(shí)，將EGFP同時(shí)轉(zhuǎn)染，利用EGFP 可發(fā)出綠色熒光的特點(diǎn)，對(duì)目的基因CXCR4 進(jìn)行觀察。熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組和治療組HUMSCs 均高表達(dá)綠色熒光，說(shuō)明基因轉(zhuǎn)染成功。為檢測(cè)目的基因CXCR4 表達(dá)情況，通過(guò)免疫熒光檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，目的基因治療組的HUMSCs 在表達(dá)綠色熒光的同時(shí)，可表達(dá)代表CXCR4 的紅色熒光，而對(duì)照組僅表達(dá)綠色熒光，正常組均未表達(dá)綠色和紅色熒光。另外western blotting 檢測(cè)也證實(shí)目的基因組HUMSCs 較對(duì)照組和正常組HUMSCs 高表達(dá)CXCR4 蛋白。以上提示經(jīng)慢病毒轉(zhuǎn)染后，HUMSCs 可過(guò)表達(dá)目的基因CXCR4。同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)染后的HUMSCs 進(jìn)行正常傳代，發(fā)現(xiàn)HUMSCs 形態(tài)無(wú)變化，仍可有較強(qiáng)的綠色熒光表達(dá)。

通過(guò)transwell 小室進(jìn)行趨化遷移試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不含有SDF- 1 的培養(yǎng)液中，過(guò)表達(dá)CXCR4 的HUMSCs 相對(duì)于正常組和對(duì)照組，遷移到transwell上室膜背面的細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而在含有100 ng/ml 的SDF-1 的培養(yǎng)液中，各組細(xì)胞的遷移數(shù)量增加，其中過(guò)表達(dá)CXCR4 的HUMSCs 遷移到膜背面的數(shù)量較其他兩組明顯增多。SDF-1 具有較強(qiáng)趨化作用，可與受體CXCR4 特異性結(jié)合，構(gòu)成的SDF-1/CXCR4 生物軸在定向趨化、遷移及募集細(xì)胞參與修復(fù)的過(guò)程中起到了重要作用。在加入SDF-1 后，各組HUMSCs 遷移數(shù)量較未加入SDF-1時(shí)增加，與以往的研究結(jié)果相一致，也說(shuō)明HUMSCs可通過(guò)SDF-1/CXCR4 生物軸作用進(jìn)行趨化、遷移。而過(guò)表達(dá)CXCR4 的HUMSCs 在有SDF-1 存在的條件下，其趨化、遷移能力明顯較對(duì)照組和正常組細(xì)胞提高。

本研究中通過(guò)慢病毒為載體轉(zhuǎn)染目的基因CXCR4 后，HUMSCs 在SDF-1 的誘導(dǎo)下，定向趨化能力明顯較未轉(zhuǎn)染CXCR4 基因的對(duì)照組和正常組HUMSCs 增強(qiáng)，遷移到transwell 上室聚碳酯膜背面的細(xì)胞數(shù)明顯增多，說(shuō)明轉(zhuǎn)染目的基因成功，在體外實(shí)驗(yàn)中證明，過(guò)表達(dá)CXCR4 的HUMSCs 趨化、遷移能力增強(qiáng)。而過(guò)表達(dá)CXCR4 的HUMSCs 在放射性肺損傷肺組織的歸巢作用如何，需進(jìn)一步驗(yàn)證，而本研究為進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了一定的理論支持。