白細(xì)胞介素4(interleukin4，IL-4)、IL-13是由2型輔助性T(Thelper2，Th2)細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，與2型炎癥反應(yīng)有關(guān)，在多種疾病如哮喘、過敏性皮炎、過敏性鼻炎、慢性阻塞性肺疾病等的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用。研究顯示，IL-4、IL-13具有共同的受體IL-4Rα/IL-13Rα1及信號(hào)通路;二者及IL-4Rα基因的多態(tài)性與哮喘、過敏等的發(fā)生發(fā)展密切聯(lián)系，它們能夠影響患者體內(nèi)IgE的水平、哮喘的嚴(yán)重程度等;此外，在哮喘和過敏性疾病中，IL-4、IL-13及其受體的表達(dá)增加，而中和或去除IL-4、IL-13及其受體，可以減輕動(dòng)物模型的癥狀�；�于此，研制抗IL-4、IL-13雙特異性抗體，中和并阻斷二者的生物學(xué)活性，有可能成為治療支氣管哮喘等過敏性疾病的重要方法。單克隆抗體(monoclonalantibody，mAb)由于其鼠源性，容易引起過敏反應(yīng)，而全人源抗體由于其編碼基因全來源于人，因此避免了鼠源性抗體的人抗鼠抗體(human-anti-mouseantibody，HAMA)反應(yīng)。但目前，國(guó)內(nèi)外還無全人源抗IL-4、IL-13雙特異性抗體上市。本課題組前期已成功構(gòu)建天然人源抗體文庫，本研究欲從中篩選高特異性的抗IL-4全人源單鏈抗體(single-chainfragmentvariable，scFv)，為后期構(gòu)建全人源的抗IL-4、IL-13雙特異性抗體奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

pET102/IL-4/BL21菌株由四川醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)教研室保存。Ni-NTA親和純化系統(tǒng)購(gòu)自Invitrogen公司;2000bpDNAladder、1000bpDNAladder、蛋白質(zhì)低相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)marker購(gòu)自TaKaRa公司。大腸桿菌TG1、輔助噬菌體M13K07均購(gòu)自Gene公司。HRP標(biāo)記的小鼠抗M13噬菌體mAb購(gòu)自AmershamBiosciences公司。IL-4蛋白購(gòu)自北京義翹生物技術(shù)有限公司。

1.2方法

1.2.1IL-4的表達(dá)純化取凍存的pET102/IL-4/BL21在Luria-Bertani氨芐青霉素(LBA)平板上劃線，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆接種到LBA液體培養(yǎng)基中，37℃，200r/min搖菌至A600達(dá)0.6左右。加入IPTG，使其終濃度為1mmol/L，30℃培養(yǎng)5h。10000r/min離心5min。采用SDS-PAGE鑒定沉淀后純化。用8mLNi-denature-GuHCl緩沖液30mL，溶解表達(dá)細(xì)菌沉淀;旋轉(zhuǎn)震蕩至徹底溶解，冰上超聲破碎。加入8mL裂解產(chǎn)物到Ni-NTA親和純化柱中，4℃結(jié)合1h，待自然沉降后流盡液體。用5mLNi-denature-urea重懸樹脂，待自然沉降后流盡液體，重復(fù)1次。用5mLNi-denature-250洗脫液重懸樹脂，待自然沉降后收集蛋白。純化得到有生物學(xué)活性的人IL-4，并進(jìn)行SDS-PAGE鑒定。

1.2.2抗IL-4全人源scFv的表達(dá)劃線培養(yǎng)大腸桿菌TG1，37℃孵育24h。挑取單克隆于LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r/min培養(yǎng)至A600為0.5～0.6左右。前期從健康人的外周血淋巴細(xì)胞mRNA中擴(kuò)增人抗體重鏈(VH)及輕鏈(Vκ和Vλ)可變區(qū)基因，用linker將其連接成人scFv基因并克隆到噬菌體載體pCANTAB25E中，電轉(zhuǎn)化E.coliTG1，構(gòu)建全人源scFv文庫，經(jīng)3輪富集后，將其稀釋至1∶10。取稀釋后的噬菌體文庫1μL到200μLA600為0.5～0.6的TG1菌株中，37℃感染10min后，涂于Luria-Bertani氨芐青霉素葡萄糖(LBAG，LB含100μg/mL氨芐青霉素和20g/L葡萄糖)的固體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取單菌落分別懸浮于LBAG培養(yǎng)基中，于37℃培養(yǎng)至A600為0.2。離心沉淀細(xì)菌，用LBA重懸細(xì)菌沉淀，加入M13K07至終濃度3×109噬斑形成單位[(plaqueformingunit，pfu)/mL]，37℃靜置10min。37℃，200r/min搖菌2h。加入卡那霉素至終劑量為20μg/mL。32℃搖菌過夜。用200mL/LPEG和2.5mol/LNaCl沉淀噬菌體，用1×PBS重懸噬菌體。

1.2.3ELISA篩選噬菌體IL-4純化蛋白經(jīng)包被液稀釋至10μg/mL，包被于酶標(biāo)板內(nèi)過夜。37℃封閉1h，洗板。噬菌體溶液中加入等倍體積封閉液，室溫封閉30min，加入至酶標(biāo)板，37℃孵育1h。洗板后，加入HRP標(biāo)記的小鼠抗M13噬菌體mAb(1∶5000)，37℃孵育1h，顯色，測(cè)450nm處的吸光度(A450)值。

1.2.4PCR檢測(cè)陽性克隆將ELISA檢測(cè)中A450值高的克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增。上游引物為5'-GGCTCGTATGTTGTGTGGA-3'，下游引物為5'-TAGCCCCCTTATTAGCGTTTG-3'。PCR擴(kuò)增條件為94℃2min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，30次循環(huán)，最后72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳、采用BstNⅠ酶切檢測(cè)其多樣性以及測(cè)序。1.2.5斑點(diǎn)雜交檢測(cè)抗IL-4人源scFv特異性取購(gòu)買的IL-4蛋白1μL(10μg/mL)點(diǎn)硝酸纖維素膜，室溫，晾干。用PBST震蕩清洗5min×3次。用50g/L脫脂奶粉封閉1h，PBST清洗5min×3次。將膜放入經(jīng)過封閉的抗IL-4全人源scFv，室溫孵育1h。洗膜3次后，加HRP標(biāo)記的小鼠抗M13噬菌體mAb(1∶10000)，室溫孵育1h。洗膜3次后，加入化學(xué)發(fā)光劑顯色、拍照、分析。

2結(jié)果

2.1人IL-4的純化及鑒定

采用Ni-NTA純化系統(tǒng)，純化得到有生物學(xué)活性的人IL-4目的融合蛋白，包括了兩端連接的標(biāo)簽，Mr大小約為27000。

2.2ELISA篩選抗IL-4全人源scFv隨機(jī)挑取經(jīng)3輪富集后的噬菌體抗體文庫的單個(gè)克隆進(jìn)行擴(kuò)增，采用ELISA檢測(cè)表達(dá)的單個(gè)scFv，陽性率約為14%。

2.3scFv的鑒定

挑取ELISA陽性的克隆，分別進(jìn)行PCR、BstNⅠ酶切鑒定。PCR結(jié)果顯示，在約1000bp處有擴(kuò)增的目的條帶，其中第11號(hào)克隆擴(kuò)增條帶大小偏小，將其去除。用限制性內(nèi)切酶BstNⅠ對(duì)篩選的陽性scFv基因進(jìn)行酶切，BstNⅠ酶切位點(diǎn)隨機(jī)分布于抗體可變區(qū)基因中，酶切后用高劑量(30～40)g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行指紋圖譜鑒定，通過比較各scFv的指紋圖譜，判定scFv序列的多樣性。酶切結(jié)果顯示，除第6株和第8株scFv指紋圖譜相同，其余均不同。選取指紋圖譜不同的且與IL-4結(jié)合能力強(qiáng)的4株scFv進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示前3株的序列正確(序列略)，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.4斑點(diǎn)雜交檢測(cè)scFv的特異性

將測(cè)序正確的3株scFv克隆表達(dá)后，用購(gòu)買的IL-4蛋白進(jìn)行斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，結(jié)果均為陽性。說明這3株scFv均能與IL-4特異性地結(jié)合。

3討論

IL-4與IL-13主要由Th2細(xì)胞產(chǎn)生，可以通過共同的受體及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮部分共同的生物學(xué)功能:IL-4、IL-13結(jié)合到由IL-4受體α(IL-4receptorα，IL-4Rα)/IL-13Rα1構(gòu)成的異二聚體受體復(fù)合物上，誘導(dǎo)多個(gè)效應(yīng)基因的表達(dá)，最終引起氣道抵抗、黏液分泌、組織纖維化，在支氣管哮喘等過敏性炎癥疾病中發(fā)揮重要作用。因此，在治療過敏性疾病中，IL-4與IL-13及其受體是極具前景的靶點(diǎn)。Tanaka等研究發(fā)現(xiàn)，抗IL-4mAb能夠抑制小鼠體內(nèi)IgE的產(chǎn)生，但不能抑制呼吸道嗜酸性粒細(xì)胞的增多及氣道高反應(yīng)性。Kelly等將Poster1013(抗IL-4Rα抗體)用于塵螨誘導(dǎo)的小鼠嗜酸細(xì)胞性哮喘，能夠抑制IgE的產(chǎn)生和氣道重構(gòu);Dupilumab(抗IL-4RαmAb)與吸入激素及長(zhǎng)效支氣管擴(kuò)張劑聯(lián)合應(yīng)用，可以減緩持續(xù)性哮喘伴有高水平嗜酸性粒細(xì)胞患者的病情惡化�？笽L-13mAb已用于臨床，但只針對(duì)某一類型的哮喘有效。由此可見，只針對(duì)單一靶點(diǎn)的治療，療效是有限的，可能是由于IL-4與IL-13表達(dá)方式有差異，且各具有多重功能。Kasaian等應(yīng)用同時(shí)針對(duì)IL-4與IL-13的拮抗劑，可以減輕小鼠肺部炎癥、氣道高敏性及IgE的產(chǎn)生。

因此，能夠同時(shí)封閉IL-4與IL-13的雙特異性全人源抗體有望獲得更好的療效，并且由于其編碼基因均來源于人，優(yōu)于鼠源性mAb。從天然人源抗體文庫中篩選出的scFv，由于未經(jīng)過體細(xì)胞的高頻突變，一般特異性和親和力都比較低。本研究從前期構(gòu)建并且經(jīng)過3輪富集的天然全人源抗體文庫中表達(dá)并篩選出3株抗IL-4scFv，經(jīng)斑點(diǎn)雜交檢測(cè)，均能與人IL-4特異性結(jié)合。后期將對(duì)其親和力作進(jìn)一步鑒定，并通過構(gòu)建突變文庫，獲得高親和力的scFv，為構(gòu)建全人源抗IL-4、IL-13雙特異性抗體奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。