豬繁殖與呼吸綜合征(porcine　reproductive　andrespiratory　syndrome，PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine　reproductive　and　respiratory　syndrome　Virus，PRRSV)引起的豬繁殖與呼吸系統(tǒng)疾病。目前該病在全球范圍廣泛流行，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的健康發(fā)展。目前根據(jù)PRRSV 基因型和抗原性差異可分為2個(gè)基因型，分別是歐洲型(基因Ⅰ型，代表株為L(zhǎng)V 株)和美洲型(基因Ⅱ型，代表株為VR-2332)。一直以來(lái)，我國(guó)主要流行株為美洲型及其變異株，但如今歐洲型PRRSV 的流行已經(jīng)打破了地域的限制，近年來(lái)相繼在福建，香港、內(nèi)蒙古等地分離到歐洲型PRRSV。而該病曾在歐洲大規(guī)模流行，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失，因此對(duì)歐洲型PRRSV 的預(yù)防顯得愈加重要。目前防控歐洲型PRRSV感染的商品化疫苗僅有滅活疫苗，但其免疫效果不十分理想，只能提供部分保護(hù)，不能預(yù)防感染。因此凾待研發(fā)一種新型有效的疫苗。

腺病毒載體在基因治療和疫苗生產(chǎn)中顯示了較好的應(yīng)用前景，其具有宿主范圍廣，病毒滴度高，可插入較大的外源基因片段且不整合到宿主基因組等特點(diǎn)，是一種應(yīng)用廣泛的基因治療載體。本研究以歐洲PRRSV　LV株ORF3、ORF5基因?yàn)閷?duì)象，以人腺病毒五型為載體，構(gòu)建重組腺病毒，并通過(guò)小鼠試驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫原性。

材料與方法

1　材料

1.1　基因、質(zhì)粒及細(xì)胞株

PRRSV　LV 株ORF3、ORF5基因由上海捷瑞生物工程有限公司合成;人腺病毒五型野毒(Adenovirus　5 wild-type，Ad5-wt)、pacd5K-N　pA 、pacad5　9.2-100質(zhì)粒和HEK　293細(xì)胞由本室保存。

1.2　試驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體重20～30g，共50只，購(gòu)于吉林長(zhǎng)春生物制品所。

1.3　主要試劑

Ex　Taq　DNA 聚合酶，DL2000Marker及各種限制性內(nèi)切酶均購(gòu)自于寶生物工程(大連)有限公司;大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司;硝酸纖維素膜購(gòu)于美國(guó)Merck　Millipore公司;小鼠抗LV 血清由本室保存;HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗購(gòu)于博士德生物工程有限公司;X-OMAT　BT醫(yī)用X射線膠片購(gòu)于加拿大Carestream公司;轉(zhuǎn)染試劑X-treme　GENE　HP購(gòu)自瑞士Roche公司;DMEM 及胎牛血清購(gòu)自美國(guó)HyClone公司;膠回收試劑盒和基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Axygen　Biosciences公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2　方法

2.1　引物設(shè)計(jì)

根據(jù)PRRSV　LV 株ORF3、ORF5基因組序列，應(yīng)用Prime　5.0設(shè)計(jì)6條引物，其中引物ORF3-R(W)中無(wú)終止密碼子，引物ORF5-F(Linker)中含有自裂解linker序列。

2.2　目的基因ORF3、ORF5的擴(kuò)增

以PUC-EUORF3、PUC-EU-ORF5質(zhì)粒為模板，分別應(yīng)用引物ORF3F/ORF3R和ORF5F/ORF5RPCR擴(kuò)增ORF3和ORF5目的基因。應(yīng)用ORF3/ORF5(W)引物擴(kuò)增不含終止密碼子的ORF3基因，應(yīng)用ORF5-F(Linker)/ORF5R 引物擴(kuò)增含有自裂解linker序列的ORF5基因，再以二者PCR 產(chǎn)物為模板，以O(shè)RF3/ORF5為引物進(jìn)行重疊PCR。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;94℃變性30s，60 ℃退火30s，72 ℃延伸1min，72℃再延伸10min。將擴(kuò)增片段連接至PMD-18TVector(于孵育器中16℃連接過(guò)夜)，構(gòu)建克隆質(zhì)粒18T-EU-ORF3、18T--EU-ORF5 和18T-EUORF3-ORF5并轉(zhuǎn)化至DH5α，而后小提質(zhì)粒并測(cè)序。

2.3　穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

將構(gòu)建的18T-EU-ORF3、18T-EU-ORF5和18T-EU-ORF3-ORF5分別與穿梭質(zhì)粒pacad5K-N　pa以BamHⅠ/XbaⅠ、XbaⅠ/NotⅠ、BamHⅠ/NotⅠ進(jìn)行雙酶切，然后在T4DNA 連接酶作用下連接、轉(zhuǎn)化，小提質(zhì)粒后酶切驗(yàn)證。

2.4　質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)染

將構(gòu)建的腺病毒穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒用PacⅠ酶切線性化后，以2μg質(zhì)粒與2μl　Xtreme　GENE　DNA 轉(zhuǎn)染試劑、200μl　OPTI-MEM 混勻后共轉(zhuǎn)染至80%的HEK　293單層細(xì)胞中，1h后補(bǔ)加10%DMEM，于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)，收集出現(xiàn)細(xì)胞病變(CPE)的HEK　293細(xì)胞。

2.5　重組腺病毒GP3、GP5、GP3-GP5 目的蛋白Western　blot檢測(cè)

取80%病變的細(xì)胞離心，沉淀加入適量細(xì)胞裂解液后冰浴30min，再以6　000r/min(離心半徑5.07cm)離心3min，取上清，與5×上樣液混勻，置沸水浴10min，然后以12%分離膠進(jìn)行SDSPAGE電泳，將膠片轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，用5%脫脂乳室溫封閉1h后加入小鼠抗LV抗體室溫振蕩孵育1h，TBST洗滌3次，每次8min;加入山羊抗小鼠二抗室溫孵育1h，TBST洗滌3次，用顯影液和定影液進(jìn)行顯影和定影，結(jié)果拍照保存。

2.6　重組腺病毒的小鼠免疫試驗(yàn)

2.6.1　小鼠分組與免疫

將50只雌性BALB/c小鼠隨機(jī)分成5組(rAd-EU-ORF3、rAd-EU-ORF5、rAd-EU-ORF3-ORF5、Ad5-wt、PBS)，每組10只，采取腿部肌肉注射免疫，免疫劑量為5×107　PFU/100μl/只，21d后加強(qiáng)免疫一次。

2.6.2　淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)

取2次免疫后14d的小鼠，無(wú)菌分離小鼠脾臟，研磨后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行小鼠脾淋巴細(xì)胞分離試驗(yàn)。分離的淋巴細(xì)胞用RPMI-2640調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106 個(gè)/ml，于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加50μl淋巴細(xì)胞(含1×105 個(gè)淋巴細(xì)胞)，并分別加入50μl　Con　A、50μl(1MOI)PRRSV滅活病毒及50μl　RPMI-1640作為非特異性刺激組、特異性刺激組與不加刺激物的對(duì)照組，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h，每孔加入10μl(5mg/ml)WST(提供中文對(duì)照)繼續(xù)培養(yǎng)3h，用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)A 值，計(jì)算刺激指數(shù)。刺激指數(shù)(SI)= (刺激孔A450值-空白對(duì)照孔A450)/(對(duì)照孔A450值-空白對(duì)照孔A450值)。

結(jié)　果

1　PRRSV　LV株ORF3、ORF5、ORF3-ORF5目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

PCR擴(kuò)增目的片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)大小分別為798、606和1　414bp，與預(yù)期值相符合。

2　穿梭質(zhì)粒pacad-EU-ORF3、pacad-EU-ORF5、pacad-EU-ORF3-ORF5酶切驗(yàn)證

將構(gòu)建的pacad-EU-ORF3以EcoRⅠ/XbaⅠ進(jìn)行雙酶切，目的片段為798bp，將pacad-EU-ORF5以XbaⅠ/NotⅠ進(jìn)行雙酶切，目的片段為606bp，將pacad-EU-ORF3-ORF5酶切驗(yàn)證以EcoRⅠ/NotⅠ進(jìn)行雙酶切，目的片段為1　414bp。均與預(yù)期結(jié)果相一致。

3　重組腺病毒鑒定

將線性化的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至HEK　293細(xì)胞后，每天觀察細(xì)胞變化，共轉(zhuǎn)染8～12d時(shí)，細(xì)胞出現(xiàn)變圓、間隙變大、細(xì)胞聚集現(xiàn)象，而對(duì)照組細(xì)胞正常，表明可能已經(jīng)包裝出重組腺病毒。

4　重組腺病毒表達(dá)產(chǎn)物的Western　blot檢測(cè)

當(dāng)80%細(xì)胞出現(xiàn)CPE時(shí)，收獲細(xì)胞及培養(yǎng)液，凍融3次，以5　000r/min離心10min，無(wú)菌收取上清，進(jìn)行Western　blot試驗(yàn)。結(jié)果顯示，rAd-EU-ORF3表達(dá)的GP3蛋白約為30ku，對(duì)照組無(wú)此蛋白;rAd-EU-ORF5 表達(dá)的GP5 蛋白約為22ku;rAd-EUORF3-ORF5表達(dá)22ku和30ku蛋白。目的蛋白分子質(zhì)量與預(yù)期結(jié)果相一致。

5　淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果

淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)顯示用LV為抗原的特異性刺激組rAd-EU-ORF3、rAd-EU-ORF5、rAd-EU-ORF3-ORF5和PBS組SI指數(shù)分別為2.425、2.230、3.477和1.444，均是PBS組1.5倍以上，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P <0.05)，且rAd-EU-ORF3-ORF5 組顯著高于rAd-EU-ORF3組和rAd-EU-ORF5組;Con　A組非特異性刺激組及對(duì)照組SI指數(shù)為1.907、1.575和1.763。

討　論

PRRS于1987年在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，該病引起母豬嚴(yán)重的繁殖障礙疾病，并在幾年內(nèi)迅速?gòu)V泛傳播于世界各地，而引起該病的病毒直至1991年在歐洲和美洲才被獨(dú)立分離。PRRS的最主要特點(diǎn)是繁殖障礙疾病，病毒可透過(guò)胎盤(pán)屏障感染給胎兒，引起母豬流產(chǎn)和早產(chǎn)及幼仔的呼吸系統(tǒng)疾病。目前國(guó)內(nèi)流行的主要是美洲型PRRSV 及其變異毒株，而對(duì)美洲型PRRSV的防控主要依靠弱毒疫苗和滅活疫苗。由于歐洲型PRRSV和美洲型PRRSV二者基因型核苷酸序列同源性僅為56～60%，且國(guó)內(nèi)尚無(wú)針對(duì)歐洲型PRRSV的疫苗，使得歐洲型PRRSV 疫苗的研發(fā)愈加重要。

PRRS結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白共同組成其免疫原性蛋白，其中GP5蛋白和M 蛋白是主要結(jié)構(gòu)蛋白，而GP5蛋白含有豐富的糖蛋白，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體。同時(shí)GP3、GP4、GP5、M 蛋白存在潛在的T細(xì)胞表位。這對(duì)誘導(dǎo)產(chǎn)生有效的PRRSV抗體極為重要。基于此因素，為預(yù)防PRRSV的感染，人們致力于亞單位疫苗的研發(fā)。Chia等報(bào)道重組桿狀病毒表達(dá)的GP3-GP5蛋白可對(duì)妊娠母豬提供68%的保護(hù)率。Jiang等以腺病毒為載體共表達(dá)的GP3-GP5，GP4-GP5，GP3-GP4-GP5免疫小鼠，結(jié)果均可刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的抗體，但僅限于小鼠免疫實(shí)驗(yàn)。而以重組雞痘病毒為載體，共表達(dá)IL-18-ORF5-ORF3，無(wú)論是中和抗體還是淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，均顯示出較好的免疫原性。

腺病毒已經(jīng)被廣泛研究60余年，人們也了解和掌握了它的許多生物學(xué)特性，而以復(fù)制缺陷型腺病毒為載體的重組疫苗在細(xì)胞內(nèi)均能高水平表達(dá)所連接的目的基因。正因如此，臨床試驗(yàn)中腺病毒載體作為一種常用載體系統(tǒng)被用于遞送外源基因。大多數(shù)腺病毒載體缺失E1區(qū)，由于E1區(qū)的缺失，使得載體在細(xì)胞系內(nèi)不能復(fù)制。研究表明E1區(qū)缺失的腺病毒載體更適用于體內(nèi)外的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。E2蛋白介導(dǎo)病毒DNA復(fù)制，E3和E4蛋白分別改變細(xì)胞的免疫反應(yīng)和細(xì)胞信號(hào)功能。本實(shí)驗(yàn)選用的重組腺病毒載體同時(shí)刪除E1區(qū)和E3區(qū)，為外源基因的插入提供更大的空間。

本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組腺病毒是將歐洲型PRRSV病毒ORF3、ORF5基因連接到穿梭質(zhì)粒上，通過(guò)重組病毒分別表達(dá)GP3、GP5及共表達(dá)GP3-GP5蛋白，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上為防止GP3和GP5蛋白融合表達(dá)，在基因組ORF3和ORF5之間添加自裂解linker，使得GP3蛋白與GP5蛋白相互獨(dú)立表達(dá)。對(duì)包裝病毒表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行western　blot驗(yàn)證，顯示重組病毒可穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白。用包裝的病毒免疫小鼠，2次免疫14d后無(wú)菌分離脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)，顯示出重組腺病毒能誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖，從而增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答水平，為PRRSV 病毒的感染預(yù)防提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。