白細(xì)胞介素-33(IL-33)是2005年發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞因子，為IL-1類細(xì)胞因子超家族成員，廣泛存在于多種組織細(xì)胞中，是炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子之一。目前認(rèn)為IL-33具有雙重生物學(xué)功能，即在正常狀態(tài)下存在于細(xì)胞核中，作為轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用;細(xì)胞損傷時(shí)釋放到胞外成為一種免疫系統(tǒng)的危險(xiǎn)信號(hào)，與受體ST2結(jié)合，作為細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。小鼠的IL-33cD-NA編碼266個(gè)氨基酸，其相應(yīng)全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為30kD。有研究表明全長(zhǎng)IL-33是參與機(jī)體活動(dòng)的有效形式，剪切后的可溶性IL-33活性下降，主要在血清中出現(xiàn)，可能成為一種疾病標(biāo)記物。但是另有研究發(fā)現(xiàn)，全長(zhǎng)IL-33經(jīng)過(guò)中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶和蛋白酶G剪切能夠產(chǎn)生生物活性10倍于全長(zhǎng)IL-33的片段。綜上所述，IL-33的活性形式依然存在爭(zhēng)議。為了進(jìn)一步研究IL-33活性，本文利用基因工程的方法在大腸埃希菌中高效表達(dá)出鼠IL-33成熟蛋白，并對(duì)免疫學(xué)活性進(jìn)行了初步研究，為深入研究IL-33的免疫學(xué)作用及其分子機(jī)制提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、菌株與質(zhì)粒C57BL/6小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;大腸埃希菌E.coli-DH5、COS-7細(xì)胞、表達(dá)載體pcDNATM3.1/myc-HisA由本室保存。

1.1.2試劑RNAisoPlus、載體連接試劑盒、限制性核酸內(nèi)切酶、PCR試劑、T4DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司，DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自北京原平皓公司，Trizol、EasyScriptcDNA第一鏈合成試劑盒為全式金公司產(chǎn)品，lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司，DMEM培養(yǎng)基、新生小牛血清、細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑購(gòu)自匯百生物公司�？筂yc的單克隆抗體購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank小鼠IL-33序列和pcDNA3.1/myc-HisA載體特性，按照酶切位點(diǎn)對(duì)側(cè)翼序列的要求設(shè)計(jì)引物并包含相應(yīng)的酶切位點(diǎn)(引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成)。IL-33上游引物:AGCAAGCTTGCCACCATGAGACCTAGAATGAAGTAT，含酶切位點(diǎn)HindⅢ;下游引物:AGCTCTAGAGATTTTCGAGAGCTTAAAC，含酶切位點(diǎn)XbaⅠ，不含終止密碼子。上游引物中含有Kozak序列。同時(shí)，調(diào)整下游引物使IL-33能融合表達(dá)Myc和HisA標(biāo)簽。

1.2.2RNA的提取及RT-PCR用RNAisoPlus提取C57BL/6小鼠肺組織總RNA，按全式金公司提供的cDNA第一鏈合成說(shuō)明進(jìn)行反應(yīng)獲得cDNA，隨即進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)獲得IL-33基因編碼序列，反應(yīng)條件:95℃5min，進(jìn)入循環(huán)，94℃30s，54℃30s，72℃1min，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。產(chǎn)物經(jīng)1%溴化乙錠-瓊脂糖凝膠電泳分離分析PCR產(chǎn)物，用DNA回收純化試劑盒回收擴(kuò)增的目的基因。

1.2.3IL-33cDNA的克隆及測(cè)序?qū)⑸鲜龌厥掌�段�?jīng)HindⅢ與XbaⅠ雙酶切，插入上述酶酶切線性化的pcDNATM3.1/myc-HisA載體，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌，過(guò)夜培養(yǎng)后挑取白色單菌落，小量提取質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切鑒定，命名為pcDNA3.1-IL-33。送南京金斯瑞生物公司進(jìn)行插入片段序列測(cè)定。

1.2.4重組質(zhì)粒的細(xì)胞轉(zhuǎn)染與表達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期COS-7細(xì)胞培養(yǎng)于含血清及雙抗的DMEM培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將3×105個(gè)細(xì)胞/孔接種于6孔板，每孔DMED培養(yǎng)基定容至3mL，培養(yǎng)24h后，采用lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑按試劑說(shuō)明轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-IL-33與空載體，并設(shè)空白對(duì)照，10h后棄去轉(zhuǎn)染液，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后24h分別收集實(shí)驗(yàn)孔及空載體對(duì)照孔、空白對(duì)照孔的細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞IL-33基因表達(dá);于轉(zhuǎn)染后不同時(shí)間用冰冷細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解產(chǎn)物，Westernblot法檢測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞IL-33表達(dá)，檢測(cè)方法按試劑說(shuō)明進(jìn)行。

2結(jié)果與分析

2.1RT-PCR擴(kuò)增小鼠IL-33基因分離小鼠肺組織總RNA，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下可見(jiàn)3條清晰條帶，分別為28SRNA、18SRNA和5SRNA，28SRNA與18SRNA無(wú)彌散現(xiàn)象，說(shuō)明RNA未被降解。總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行PCR反應(yīng)，將產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)一亮帶，大小約801bp，與IL-33基因片斷預(yù)期大小相符。

2.2pcDNA3.1-IL-33真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建HindⅢ與XbaⅠ雙酶切后的小鼠肺組織IL-33的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳回收，與上述酶酶切后的pcDNA3.1/myc-HisA進(jìn)行定向連接，連接后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌。抽提質(zhì)粒，行HindⅢ與XbaⅠ雙酶切鑒定，經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期相符。南京金斯瑞生物科技有限公司DNA測(cè)序結(jié)果與IL-33cDNA序列一致。

2.3重組質(zhì)粒在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)分別收集空白對(duì)照、pcDNA3.1-IL-33與空載體轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，從重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中可擴(kuò)增出IL-33基因，而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中未擴(kuò)增出目的條帶，Westernblot法證實(shí)pcDNA3.1-IL-33轉(zhuǎn)染細(xì)胞48h后的細(xì)胞裂解產(chǎn)物可檢測(cè)到IL-33，而空載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞未檢測(cè)到其表達(dá)。

3討論

IL-33作為新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞因子和核因子，在炎癥性腸病中扮演重要角色。有研究認(rèn)為IL-33具有“警報(bào)素”作用，當(dāng)各種原因?qū)е履c上皮細(xì)胞破壞時(shí)，IL-33作為一種危險(xiǎn)信號(hào)從細(xì)胞中釋放，激活肥大細(xì)胞和嗜堿、嗜酸性粒細(xì)胞等，促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，并促進(jìn)初始性T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，趨化Th2細(xì)胞到達(dá)病灶，發(fā)揮促炎作用。同時(shí)，還有研究發(fā)現(xiàn)IL-33能使炎癥性腸病動(dòng)物模型炎癥程度減輕，癥狀改善，說(shuō)明IL-33能抑制炎癥進(jìn)展�？傊�，目前研究表明IL-33在炎癥性腸病發(fā)病中可能具有雙重作用，其參與炎癥性腸病炎癥進(jìn)展的具體作用機(jī)制仍未完全清楚，且需進(jìn)一步發(fā)掘并探索IL-33是否具有治療價(jià)值。

本研究選擇真核表達(dá)載體pcDNATM3.1/myc-HisA，成功構(gòu)建了pcDNA3.1-IL-33真核表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞能夠成功表達(dá)帶Myc、His標(biāo)簽的小鼠IL-33全長(zhǎng)蛋白。下一步可以通過(guò)6×His標(biāo)簽對(duì)IL-33融合蛋白進(jìn)行純化，通過(guò)pull-down實(shí)驗(yàn)研究篩選IL-33相互作用蛋白。此外，Myc標(biāo)簽還可以用于免疫共沉淀和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，為研究IL-33蛋白在體內(nèi)的作用及信號(hào)通路提供了有力的工具。雖然本研究已經(jīng)成功構(gòu)建全長(zhǎng)IL-33的真核表達(dá)質(zhì)粒，但由于不同大小IL-33的活性及作用一直存在爭(zhēng)議，需要進(jìn)一步克隆不同大小的IL-33序列并構(gòu)建其真核表達(dá)質(zhì)粒，為進(jìn)一步研究IL-33的功能和活性提供工具。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了帶His、Myc雙標(biāo)簽的pcDNA3.1-IL-33真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染到COS-7細(xì)胞并在體外成功表達(dá)了帶HisA和Myc雙標(biāo)簽的小鼠IL-33全長(zhǎng)蛋白，為下一步研究IL-33在炎癥性腸病的作用及其分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。