穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后，要想得到外源基因整合到宿主細(xì)胞染色體組中，并能穩(wěn)定表達(dá)靶基因的單克隆細(xì)胞，需要在帶有抗生素的選擇培養(yǎng)基中對多克隆進(jìn)行有限稀釋法的分離培養(yǎng)，絲裂霉素 C 處理的飼養(yǎng)細(xì)胞對單個細(xì)胞的營養(yǎng)和支持作用十分關(guān)鍵，然而個別飼養(yǎng)細(xì)胞在培養(yǎng)過程中可能復(fù)燃從而混入單克隆細(xì)胞中，導(dǎo)致單克隆分離擴(kuò)增的失敗。而傳統(tǒng)的單克隆檢測需要設(shè)計多對覆蓋外源基因結(jié)構(gòu)片段的引物，多次重復(fù)進(jìn)行提取核酸再做 PCR、電泳等，耗時費(fèi)力。本文針對以上關(guān)鍵步驟進(jìn)行改良優(yōu)化，利用無飼養(yǎng)細(xì)胞(nofeeder cells)的改良分離培養(yǎng)基進(jìn)行了單克隆的分離和培養(yǎng)，并結(jié)合熒光素酶報告基因快速檢測法，從多克隆中迅速有效的篩選出轉(zhuǎn)染成功的單克隆。本文中介紹的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染(電穿孔法)后單克隆細(xì)胞的篩出策略大大提高了檢出效率，縮減時程和耗材，減免了多次重復(fù)篩選的人力物力。改良法有效縮短實(shí)驗(yàn)研究周期，能為臨床和科研提供簡捷可靠的單克隆純化和鑒定的手段，以下進(jìn)行詳細(xì)介紹。

1 方法與步驟

本研究使用懸浮生長的 T 淋巴細(xì)胞系Jurkat 做為轉(zhuǎn)基因靶細(xì)胞，利用電穿孔穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法的高電壓 (270 V 電壓，950μF 電容和 0.4 cm 的放電杯，Bio RAD 電穿孔儀)將外源人工合成的質(zhì)粒導(dǎo)入 Jurkat 細(xì)胞中，經(jīng)過約1w 的含抗生素分離培養(yǎng)基(潮霉素 Hygrimycin B 濃度為 40μg/ml)的篩選培養(yǎng)，初步得到整合有攜帶抗性基因標(biāo)記質(zhì)粒的多克隆細(xì)胞，而將外源基因未整合入基因組的不穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞多數(shù)篩除。將細(xì)胞計數(shù)并利用有限稀釋法稀釋，一傳統(tǒng)組含有絲裂霉素C(40μg/ml，30 mins，Sigma)處理的懸浮Jurkat 飼養(yǎng)細(xì)胞濃度為 1.5×104/ml，96 孔培養(yǎng)板中每孔含約 200 μl 加有飼養(yǎng)細(xì)胞的選擇培養(yǎng)基并含有一個候選靶細(xì)胞，其中 16 個對照孔不含候選單克隆細(xì)胞，每板設(shè)置8 孔陰性對照為未加有絲分裂原處理的原始細(xì)胞，培養(yǎng)過程中由于潮霉素的作用一直緩慢平穩(wěn)增殖，而另外8 孔加入致死量高濃度絲裂霉素 C 處理的 Jurkat 做陽性對照，培養(yǎng)過程中會提前全部凋亡，陰陽對照做為飼養(yǎng)細(xì)胞的生長參照。另一改良組培養(yǎng)基無飼養(yǎng)細(xì)胞成分，培養(yǎng)基來自一天前換液傳代的同種 T 淋巴細(xì)胞的離心后(1500 rpm，10min)的培養(yǎng)上清，當(dāng)時其上清供體細(xì)胞的濃度為 1.5×105/ml。兩組培養(yǎng)板每 2 天半量換液 100 μl，傳統(tǒng)組使用新鮮配制的RPMI-1640(Sigma，10% FCS)懸浮細(xì)胞專用培養(yǎng)基，新鮮加入潮霉素B 至 40μg/ml，改良組仍然加入含有等量抗生素濃度的離心后細(xì)胞的培養(yǎng)上清100 μl。顯微鏡觀察兩組細(xì)胞培養(yǎng)的各孔，直到發(fā)現(xiàn)分裂增殖的細(xì)胞克隆，多數(shù)孔單細(xì)胞凋亡，將發(fā)現(xiàn)的存活并擴(kuò)增成功的單細(xì)胞分別漸次移入48 孔、24 孔、6 孔培養(yǎng)板和25 cm 培養(yǎng)瓶中，逐步擴(kuò)增數(shù)量。熒光素酶報告實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)是轉(zhuǎn)入T 淋巴細(xì)胞的外源質(zhì)粒表達(dá)的是含有 GAL4 的融合蛋白能夠與熒光報告質(zhì)粒上的 GAL4 結(jié)合位點(diǎn)作用啟動熒光素酶的表達(dá)，因此只要細(xì)胞熒光活性增強(qiáng)則表明熒光素酶的啟動子被激活，細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染了特定標(biāo)簽的外源基因，熒光素酶與底物反應(yīng)產(chǎn)生的熒光素可用 Luminometer 檢測與待測外源蛋白的作用強(qiáng)度成正比。將擴(kuò)增好的候選的多個單克隆、轉(zhuǎn)染靶基因的多克隆及空白對照的 Jurkat 細(xì)胞用pFR-Luc 熒光質(zhì)粒進(jìn)行 DEAE- 葡聚糖介導(dǎo)法轉(zhuǎn)染，在熒光測定儀上檢測 100μl 熒光報告裂解緩沖液(Promega)的熒光活性，用蛋白含量(Beckman DU640，750nm)校正得到相對熒光活性單位。對比二者方法的單克隆得率%，同時對只含有 Feeder 的陰陽對照培養(yǎng)孔觀察分析，是否兩周時間全部凋亡或仍然穩(wěn)定增殖中，來判斷培養(yǎng)條件是否穩(wěn)定有效。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)法和改良法的獨(dú)立三次單克隆化存活細(xì)胞克隆比較

對傳統(tǒng)法和改良無飼養(yǎng)細(xì)胞法分離單克隆的可操作性進(jìn)行比較，進(jìn)行了三次獨(dú)立的培養(yǎng)，如方法與步驟中介紹，首先用電穿孔法穩(wěn)定轉(zhuǎn)染靶基因質(zhì)粒進(jìn)入 T 淋巴細(xì)胞系Jurkat，經(jīng)過一周抗性篩選在潮霉素分離培養(yǎng)基中初步得到存活的多克隆細(xì)胞。有限稀釋后在96 孔板中培養(yǎng)，傳統(tǒng)的飼養(yǎng)細(xì)胞法每 96 孔板設(shè)立 8 個陰性和 8 個陽性對照，改良的無飼養(yǎng)細(xì)胞法每個 96 孔板中設(shè)立 8 個孔為陰性對照，換液時只添加含選擇抗生素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，非含豐富細(xì)胞刺激生長因子的無細(xì)胞培養(yǎng)上清。因此第一次培養(yǎng)傳統(tǒng)法 3 塊 96 孔板含單細(xì)胞孔為240 個，第二次5 塊96 孔板400 個，第三次6 塊96 孔板480 個;而相應(yīng)的改良法則第一次培養(yǎng)傳統(tǒng)法 3 塊 96 孔板含單細(xì)胞孔為 264 個，第二次5 塊96 孔板440 個，第三次6 塊 96 孔板528 個。每日觀察孔中是否有細(xì)胞和細(xì)胞分裂情況，記錄并編號。兩周后將增殖成團(tuán)的細(xì)胞依次移入 48 孔、24 孔、6 孔培養(yǎng)板和25 cm 培養(yǎng)瓶中，逐步擴(kuò)增數(shù)量，進(jìn)入48 孔擴(kuò)增后傳統(tǒng)組也無需飼養(yǎng)細(xì)胞。以最終能在 25 cm 培養(yǎng)瓶中的選擇培養(yǎng)基中正常增殖的細(xì)胞計算成活率。

根據(jù)表格數(shù)據(jù)顯示，無飼養(yǎng)細(xì)胞存在，單個細(xì)胞在含有生長刺激因子的培養(yǎng)上清中也能增殖分裂，且成活比率較高，而對照8 孔中用普通分離培養(yǎng)基(含潮霉素)換液的單個細(xì)胞全部凋亡�？梢姂腋〉膯蝹�T 淋巴細(xì)胞對細(xì)胞生長刺激因子依賴較強(qiáng)而對細(xì)胞密度依賴較低。飼養(yǎng)細(xì)胞組陰性對照孔僅有用絲裂霉素 C 處理的細(xì)胞不含單個靶細(xì)胞，兩周后個別孔仍有細(xì)胞增殖，陽性致死量100μg/ml 處理的飼養(yǎng)細(xì)胞在一周內(nèi)全部凋亡。總的成活率傳統(tǒng)法和改良法分別為5.27% 和4.55%，統(tǒng)計軟件SPSS 11.5 分析(P=0.417)無顯著差異。而單個細(xì)胞擴(kuò)增成活的克隆未必是單克隆，可能是復(fù)燃的飼養(yǎng)細(xì)胞形成的假克隆或單克隆與假克隆的混合體(根據(jù)觀察到的僅有飼養(yǎng)細(xì)胞的對照孔培養(yǎng)兩周后，在 96 孔板中 5% ～ 8% 的 feeders 孔仍然存活)，或不完整整合的突變細(xì)胞克隆，這要通過以下步驟鑒別。

2.2 未整合細(xì)胞克隆、多克隆和單克隆鑒別：存活細(xì)胞的熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)兩組(傳統(tǒng)法和改良法)存活并擴(kuò)增成功的細(xì)胞克隆在培養(yǎng)瓶中增殖，取各瓶中2×106 個細(xì)胞，用 DEAE- 葡聚糖瞬時轉(zhuǎn)染法，將10 μg pFR 報告 LUC 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入，從報告裂解液中獲取 LUC 蛋白熒光，測量底物激發(fā)信號 20 s，原始熒光活性經(jīng)過 750 λ 波長蛋白濃度的校正得到相對熒光活性。未整合細(xì)胞克隆、多克隆和單克隆的熒光信號依次遞增，差異顯著。因此根據(jù)相對熒光活性單位數(shù)值判斷未整合細(xì)胞克隆、混合多克隆和單克隆簡單快速。熒光報告質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)原理和由此進(jìn)一步篩選出的含有靶基因中標(biāo)記融合基因 GAL4 的單克隆比率。

2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染外源基因的單克隆細(xì)胞的分離鑒別策略流程。電穿孔穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的多克隆，有限稀釋后用飼養(yǎng)細(xì)胞或無飼養(yǎng)細(xì)胞法分離單克隆，再用熒光素酶實(shí)驗(yàn)鑒定標(biāo)記基因的表達(dá)，再提取DNA 做引物PCR 鑒定重要區(qū)域片段的存在，得到完整整合靶基因的單克隆進(jìn)一步通過 RNA 逆轉(zhuǎn)錄PCR 確定其轉(zhuǎn)錄水平或免疫印跡(WB)/免疫細(xì)胞組化 ICC 等方法確認(rèn)蛋白的表達(dá)，單克隆分離鑒定策略的簡易流程。

3 結(jié)論

無飼養(yǎng)細(xì)胞法分離增殖的單克隆策略有效避免了支持作用的飼養(yǎng)細(xì)胞復(fù)燃污染混入單克隆中，從而針對飼養(yǎng)細(xì)胞可能的優(yōu)勢增生后果，進(jìn)行有效預(yù)防，利用同種非轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中含有多種生長因子的濾液能有效刺激單細(xì)胞生長的原理進(jìn)行單克隆培養(yǎng)，換液和擴(kuò)增，該法去除了飼養(yǎng)細(xì)胞的繁瑣制備步驟，不必有絲分裂抑制劑處理和對其濃度的優(yōu)化探索，節(jié)約了試劑和時間，最終分離到純化的單克隆。熒光素酶報告基因?qū)嶒?yàn)根據(jù)相對熒光活性單位的顯著差異，對靶基因攜帶的熒光標(biāo)記蛋白的表達(dá)進(jìn)行區(qū)別確認(rèn)，從而有效區(qū)分了為轉(zhuǎn)染細(xì)胞、多克隆和單克隆細(xì)胞。只需對少數(shù)的候選單克隆進(jìn)行的特異引物PCR、電泳和WB[5]，則可明確靶基因穩(wěn)定完整的存在并表達(dá)于篩選的單克隆細(xì)胞中。該方法省時省力、簡便快捷，特別是縮減了大批量提取核酸及多次 PCR 和電泳的時間和耗費(fèi)，優(yōu)化了篩選流程，為臨床、基礎(chǔ)科研縮短時程、提高效率提供了有益的改良方案。

4 討論

在體外的細(xì)胞培養(yǎng)中，單個的或數(shù)量很少的細(xì)胞不易生存與繁殖，必須加入其它活的細(xì)胞才能使其生長繁殖，這種飼養(yǎng)細(xì)胞往往用轉(zhuǎn)染前的同種細(xì)胞經(jīng)過絲裂霉素C 或紫外照射處理，抑制其增殖，在兩周左右的單克隆篩選培養(yǎng)基中逐漸凋亡。而含有抗生素抗性基因的單個靶細(xì)胞克隆則在飼養(yǎng)細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和 Feeder 提供的細(xì)胞間信息交流的刺激下不斷擴(kuò)增。改良的無飼養(yǎng)細(xì)胞法從正常細(xì)胞培養(yǎng)上清中離心過濾得到無細(xì)胞的培養(yǎng)基，含有刺激細(xì)胞分裂的有效因子成分，能有效避免非靶細(xì)胞的污染和有絲分裂抑制劑處理后藥物殘余或非轉(zhuǎn)染細(xì)胞的復(fù)燃和混入，從而得到純化的單克隆細(xì)胞。

3 次培養(yǎng)總的存活率傳統(tǒng)飼養(yǎng)細(xì)胞法略高于改良無飼養(yǎng)細(xì)胞法(5.27% VS 4.55%)，可能與單個轉(zhuǎn)染細(xì)胞對細(xì)胞密度的一定依賴性和Feeders 提供更全面的刺激信號有關(guān)，個別Feeders 細(xì)胞在培養(yǎng)基中逐漸復(fù)燃，而絲裂霉素C 處理后細(xì)胞雖然經(jīng)過清洗，但極微量的殘余也可能影響單細(xì)胞的擴(kuò)增，因此比率只略高而無顯著差異。

熒光素酶法報告基因鑒別法，簡單快速，熒光信號強(qiáng)，結(jié)果明確。再輔助以多對關(guān)鍵靶基因片段的引物 PCR 實(shí)驗(yàn)，結(jié)合 RNA 逆轉(zhuǎn)錄 cDNA 的 PCR 檢測和免疫印跡確認(rèn)蛋白表達(dá)能準(zhǔn)確有效的篩選出目標(biāo)單克隆。本文總的單克隆的分離比例低于 0.8%，如從換液的成分、比例和選擇抗生素的濃度進(jìn)一步優(yōu)化，可能提高單克隆的得率，還需繼續(xù)優(yōu)化探索篩選的策略。遺傳背景一致的單克隆細(xì)胞對外源基因或蛋白高表達(dá)穩(wěn)定而持久，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用方便結(jié)果可重復(fù)性好、富有說服力，在分子遺傳、蛋白質(zhì)組學(xué)等領(lǐng)域有廣闊應(yīng)用前景。