巨噬細胞移動抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor，MIF)是一種具有多種生物學功能的細胞因子，位于“炎癥瀑布”的上游，可以調(diào)節(jié)炎性因子的產(chǎn)生和釋放，通過自分泌或旁分泌方式發(fā)揮作用，促使巨噬細胞聚集在損傷區(qū)域。研究發(fā)現(xiàn)，15-脫氧-前列腺素J2(15-Deoxy-Δ12，14-prostaglandinJ2，15d-PGJ2)能夠在慢性肝損傷時抑制小鼠體內(nèi)骨髓來源的單核巨噬細胞(bonemarrowderivedmonocyte/macrophage，BMM)向損傷區(qū)域募集，并能夠抑制體外培養(yǎng)小鼠單核巨噬細胞的生物學功能，但其作用靶點尚未明確。本研究以小鼠單核巨噬細胞系J774A.1為研究對象，以MIF為靶分子，在體外脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導的炎癥模型中探討15d-PGJ2對MIF表達的影響及其機制。

材料和方法

材料

小鼠單核巨噬細胞系J774A.1(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心細胞庫);DMEM培養(yǎng)基(美國Invitrogen公司)，胎牛血清(德國Biochromag公司)，胰蛋白酶、β-巰基乙醇、青霉素/鏈霉素(美國GIBICO/BRL公司)，15d-PGJ2(美國AnnArbor公司)，LPS(美國Sigma公司);RNeasyMimiKit(德國Quagen公司)，M-MLV逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)，SYBRGreenPCRMasterMix，TaqmanUniversalPCRMasterMix(美國ABI公司);抗GAPDH單克隆抗體(美國CellSignalingTechnology公司)，抗MIF多克隆抗體、抗F4/80多克隆抗體、抗PPAR-γ多克隆抗體(美國SantaCruzBiotechenology公司)。

細胞培養(yǎng) J774A.1接種于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，接種密度1×106/r=10cm細胞培養(yǎng)皿或3×105/r=6cm細胞培養(yǎng)皿，細胞匯合到90%時進行傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

細胞的藥物處理 細胞匯合到80%時給予藥物處理。細胞饑餓12h，分別給予以下處理:(1)LPS組:1μg/mlLPS孵育1h;(2)正常對照組:LPS的溶劑PBS孵育1h;(3)陰性對照組:5μmol/L15d-PGJ2孵育1h;(4)15d-PGJ2組:5μmol/L15d-PGJ2預孵育1h，1μg/mlLPS孵育1h;(5)GW9662組:10μmol/LGW9662預孵育1h，5μmol/L15d-PGJ2孵育1h，1μg/mlLPS孵育1h;(6)Vehicle組:即GW9662對照組，使用GW9662的溶劑DMSO替代GW9662。

細胞免疫熒光 細胞接種于96孔板中，1×104/孔，貼壁后用預冷的PBS清洗，4%多聚甲醛室溫避光固定15min;用0.5%TritonX-100進行膜通透處理，2%BSA封閉;MIF(1∶50)抗體孵育，4℃過夜;F4/80(1∶200)抗體孵育，37℃1h;加入相應熒光標記二抗，37℃1h，避光;DAPI染細胞核后高內(nèi)涵自動成像系統(tǒng)進行掃描。陰性對照組不加一抗，其余處理與實驗組相同。

RT-qPCR 處理后的細胞用預冷PBS清洗，加入350μl裂解液，收集裂解底物提取全細胞RNA(QIAGENRNeasyMiniKit)，定量(NanoVue)后取0.5μg逆轉錄(不加逆轉錄酶作為陰性對照，即NO-RT)，cDNA稀釋后進行PCR反應，引物序列。檢測的臨界點設定在PCR擴增過程中，熒光信號由本底進入指數(shù)增長階段的拐點所對應的循環(huán)數(shù)(Ct)作為模板初始濃度的間接指標，溶解曲線分析采用默認條件。結果以18SrRNA進行校正，用ΔΔCt法計算相對基因表達量。取PCR產(chǎn)物DNA進行瓊脂糖凝膠電泳。膠濃度為2%，電壓為100V，電泳時間45min，紫外燈下觀察并打印膠片。

Westernblot檢測 處理后的細胞用預冷的PBS清洗，0.125%胰酶消化后加入蛋白裂解液，提取全細胞蛋白，BCA法蛋白定量(BCATMproteinassaykit)。取50μg總蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(膠濃度15%)，轉膜至0.2μm的PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉1h，孵育MIF抗體(1∶200稀釋)，4℃過夜。PBST洗膜5min，3次，孵育相應二抗，室溫避光1h。PBST洗膜后Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)掃描成像并進行定量分析。內(nèi)參GAPDH測定步驟相同。

免疫熒光法測定 細胞內(nèi)過氧化物酶體增殖物激活受體γ的含量及高內(nèi)涵分析細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔1×104個細胞，過夜貼壁。給予藥物處理后，進行免疫熒光染色，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisomeproliferator-activatedreceptor-γ，PPAR-γ)抗體(1∶50稀釋)孵育，DAPI染細胞核后使用高內(nèi)涵儀器配備的ThermoScientificCellInsightpersonalcellimaging(PCI)平臺及ThermoScientificCellomicsiDEV軟件對96孔板進行掃描成像。機器掃描時，每孔隨機選取49個視野，且細胞數(shù)目不小于4000個。采用CellomicsCellHealthProfilingBioApplication軟件對熒光強度信息進行分析，定量測定各處理條件下J774A.1中PPAR-γ的含量。分析結束后，根據(jù)需要選擇輸出圖像和數(shù)據(jù)統(tǒng)計結果。結果以細胞核內(nèi)熒光強度/細胞質(zhì)內(nèi)熒光強度±標準誤形式給出。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準誤表示，組間比較采用student’st檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

J774A.1在基因和蛋白水平均表達MIF細胞免疫熒光檢測結果顯示，MIF蛋白(紅色熒光)在J774A.1中有表達，且與小鼠單核/巨噬細胞的表面標志物F4/80(綠色熒光)有共定位。引物設計PCR產(chǎn)物MIF片段的分子量為118bp，用瓊脂糖凝膠電泳技術在相應位置檢測到MIF的存在。15d-PGJ2下調(diào)J774A.1細胞炎癥模型中MIFmRNA和蛋白表達水平用1μg/mlLPS誘導J774A.1炎癥反應，RT-qPCR方法檢測到細胞中MIFmRNA表達上調(diào)到對照組的1.75倍(P=0.037)。給予細胞5μmol/L15d-PGJ2預孵育1h后再用LPS誘導炎癥反應，細胞中MIFmRNA表達的上調(diào)被抑制，下調(diào)到LPS組的50%(P=0.026)。單獨應用15d-PGJ2處理組細胞中MIFmRNA表達水平與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.099)。MIF蛋白水平變化情況與mRNA水平相一致。GW9662逆轉15d-PGJ2對MIFmRNA和蛋白表達的抑制功能用PPAR-γ拮抗劑GW9662預處理細胞，再孵育5μmol/L15d-PGJ21h后，用1μg/mlLPS誘導細胞炎癥反應，RT-qPCR檢測結果顯示，與Vehicle組相比，GW9662逆轉了15d-PGJ2對MIFmRNA表達的下調(diào)(P=0.016)。單獨給予GW9662處理對MIFmRNA表達無影響(P=0.26)。MIF蛋白水平變化情況與mRNA水平相一致。15d-PGJ2調(diào)節(jié)炎癥反應時J774A.1中PPAR-γ的核轉位細胞饑餓12h后，用1μg/mlLPS誘導細胞炎癥反應，給予或不給予5μmol/L15d-PGJ2處理，1h后終止。用免疫熒光技術特異性顯示PPAR-γ后發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，LPS組細胞內(nèi)PPAR-γ的核質(zhì)比沒有明顯變化(P=0.161)，15d-PGJ2處理組細胞的胞核中PPAR-γ含量明顯上調(diào)。高內(nèi)涵自動成像系統(tǒng)分析結果顯示，15d-PGJ2處理組細胞中PPAR-γ的核質(zhì)比上調(diào)至LPS組的1.39倍(P=0.003)。

討論

炎癥反應是組織器官受到損傷因素刺激后的一種免疫防御反應，是多種慢性疾病的主要誘發(fā)因素。作為免疫系統(tǒng)的第1道防線，單核巨噬細胞在接受LPS等刺激后可釋放大量炎癥介質(zhì)和促炎因子，如MIF等，介導炎癥反應的發(fā)生發(fā)展以及組織損傷。MIF是一種作用廣泛的前炎癥細胞因子，可通過自分泌和旁分泌的方式參與炎癥反應，能夠促進其他細胞因子(如腫瘤壞死因子α等)的產(chǎn)生、活化巨噬細胞、抑制其游走移動等。本研究明確了小鼠單核巨噬細胞系J774A.1表達MIF，且LPS誘導的J774A.1炎癥反應模型中其表達上調(diào)，并發(fā)現(xiàn)該上調(diào)可被15d-PGJ2抑制，提示MIF可能是15d-PGJ2發(fā)揮抗炎功能的重要作用靶點。