結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)引起的以呼吸道病變?yōu)橹鞯囊环N慢性傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新統(tǒng)計，僅2013年約900萬例新發(fā)結(jié)核病病例，約150萬人死亡�？ń槊�(BacillusCalmetteGuerinvaccine，BCG)是使用最廣泛、最安全的預(yù)防結(jié)核病的唯一疫苗，但它在不同地區(qū)和接種人群中免疫效果不穩(wěn)定，為0%～80%不等，其具體的機(jī)制不明。鋅依賴的金屬蛋白酶1(zinc-dependentmetalloprotease1，Zmp1)是MTB的一種毒力因子。Zmp1與MTB的致病關(guān)系密切，可影響吞噬體與溶酶體的融合而使MTB逃避免疫清除。巨噬細(xì)胞是MTB感染與免疫形成的關(guān)鍵細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的凋亡在機(jī)體抵抗病原菌的感染有重要作用。BCG中的Zmp1對巨噬細(xì)胞的增殖凋亡有無影響目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報道。本研究旨在構(gòu)建BCG的zmp1基因含增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFPN1-zmp1，并轉(zhuǎn)染RAW264.7巨噬細(xì)胞，觀察zmp1基因表達(dá)產(chǎn)物對巨噬細(xì)胞凋亡的影響。為進(jìn)一步明確Zmp1對巨噬細(xì)胞的作用、Zmp1對免疫功能的影響奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

pEGFP-N1質(zhì)粒、Top10菌株、BCG菌株(丹麥株)均由重慶醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)與腫瘤研究中心實(shí)驗(yàn)室保存;RAW264.7細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)研究院惠贈;500bpDNAladder購自北京天根生化科技有限公司;限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、XhoⅠ均購自大連寶生物工程有限公司;1×高糖DMEM、2.5g/L胰蛋白酶溶液、胎牛血清(fetalbovineserum，F(xiàn)BS)均購自Hyclone公司、LipofectamineTM2000Reagent均購自Invitrogen公司。藻紅蛋白標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/7-氨基放線菌素D(annexinⅤ-phycoerythrin/7-amino-actinomycin，annexinⅤ-PE/7-AAD)雙染色試劑盒購自上海前塵生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計及合成根據(jù)GenBank登錄的zmp1基因序列(NP_214712.1)，以真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1為框架設(shè)計2條zmp1基因PCR擴(kuò)增引物并添加酶切位點(diǎn)，上、下游引物序列分別如下(酶切位點(diǎn)為波浪線部分):P1:5'-AAACTCGAGGCCACCATGGTGACACTTGCCATCCCC-3';P2:5'-AAAGGATCCGTTCCAGATCCGG-3';P1設(shè)計限制性內(nèi)切酶XhoⅠ酶切位點(diǎn)，同時引入Kozak序列(劃線部分)和起始密碼子(ATG);P2設(shè)計限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切位點(diǎn)，同時刪除zmp1基因C端的終止密碼子，引物交由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2.2構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-N1-zmp1BCG菌全基因組DNA為模板，PCR法擴(kuò)增zmp1基因片段，反應(yīng)體系50μL:5×高保真酶緩沖液10μL，高保真酶1μL，BCG菌全基因組DNA1μL，dNTP混合物4μL，引物P1和P2各1μL，滅菌雙蒸水32μL。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10min，(95℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸2min)×32個循環(huán);72℃延伸10min;反應(yīng)產(chǎn)物16℃降溫5min。經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，按照試劑盒說明書進(jìn)行回收純化大小約2000bp的特異性PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物和pEGFP-N1質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切，回收純化zmp1片段和質(zhì)粒片段;連接質(zhì)粒片段與zmp1基因片段連接反應(yīng)體系(20.0μL):10×T4緩沖液2.0μL、T4DNA連接酶1.0μL、pEGFP-N1質(zhì)粒片段1.0μL、zmp1基因雙酶切產(chǎn)物10.0μL、滅菌雙蒸水6.0μL、4℃連接12h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞中，用LB(含卡那霉素20μg/mL)平板篩選陽性克隆，挑取陽性克隆單菌落接種到5mLLB(含卡那霉素20μg/mL)液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12～14h，提取質(zhì)粒。

1.2.3重組質(zhì)粒鑒定菌落PCR法篩選鑒定陽性克隆，以挑單菌落的菌液為模板克隆zmp1基因;10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，分析結(jié)果。提取陽性克隆菌質(zhì)粒酶切鑒定，經(jīng)XhoⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，酶切反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果。對雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行核酸DNA雙向測序鑒定。

1.2.4重組質(zhì)粒在RAW264.7細(xì)胞中表達(dá)將核酸測序正確的重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，37℃恒溫50mL/LCO2靜置培養(yǎng)，同時以pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞作為對照組。轉(zhuǎn)染后24h，熒光倒置顯微鏡觀察熒光表達(dá)。

1.2.5實(shí)時熒光定量PCR檢測zmp1mRNA表達(dá)水平質(zhì)粒pEGFP-N1-zmp1轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞48h后，根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取RAW264.7細(xì)胞總RNA;按照TaKaRaPrimeScriptTMⅡ1stStrandcDNASynthesisKit說明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增zmp1基因上、下游引物(P3、P4)和β-actin上、下游引物(P5、P6)。P3為5'-ACGGGGGCGAGAGCCGTGAC-3'，P4為5'-CCAGTCTTCAACGTTAACGC-3';P5為5'-AACTCCATCATGAAGTGTGAC-3'，P6為5'-TAACGCAACTAAGTCATAGTC-3'。實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)體系(15.0μL):SYBR�K7.5μL、P3/P50.3μL、P4/P60.3μL、cDNA3.0μL、滅菌雙蒸水6.6μL;95℃5min、95℃10s、60℃15s、72℃20s，循環(huán)39次;72℃延伸6min。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)檢測Zmp1蛋白對巨噬細(xì)胞凋亡影響實(shí)驗(yàn)分為3組，空白組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組)、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒組(空質(zhì)粒對照組)、轉(zhuǎn)染pEGFP-N1-zmp1質(zhì)粒組(實(shí)驗(yàn)組);轉(zhuǎn)染后48h，用不含EDTA的2.5g/L胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，室溫下1500r/min離心5min，棄上清;適量PBS洗滌細(xì)胞2～3次;以1×結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106個/mL;取100μL細(xì)胞懸液于5mL流式管中，加入5μLannexinⅤ-PE和10μL7-AAD，輕輕混勻;避光、室溫反應(yīng)15min;加入400μL1×結(jié)合緩沖液，混勻，流式細(xì)胞術(shù)檢測，每組實(shí)驗(yàn)分別獨(dú)立重復(fù)3次。

2結(jié)果

2.1zmp1基因片段的擴(kuò)增和鑒定

分別以BCG基因組和重組質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增zmp1基因片段，PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分析，在2000bp左右出現(xiàn)特異性條帶，條帶大小與預(yù)期值相同。重組質(zhì)粒pEGFP-N1-zmp1經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后，產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳分離，分別得到大小約4700bp和2000bp的條帶。重組質(zhì)粒DNA測序結(jié)果與GenBank登錄的MTB中zmp1(NP_214712.1)基因序列比對顯示完全相同，提示zmp1成功插入pEGFP-N1質(zhì)粒中。

2.2zmp1mRNA在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)和鑒定

轉(zhuǎn)染后48h，提取細(xì)胞總RNA并通過逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA，以cDNA作為模板和β-actin作為內(nèi)參檢測zmp1的表達(dá)。結(jié)果顯示，僅pEGFP-N1-zmp1轉(zhuǎn)染組檢測到zmp1mRNA表達(dá)，pEGFP-N1轉(zhuǎn)染組和空白對照組(未轉(zhuǎn)染)均未檢測到zmp1mRNA表達(dá)。

2.3各組RAW264.7細(xì)胞凋亡檢測

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)分析顯示，轉(zhuǎn)染后48h，實(shí)驗(yàn)組與空白組和對照組比較，早期凋亡率和壞死率有所增高，存活率有所下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3討論

巨噬細(xì)胞既是分枝桿菌感染的宿主細(xì)胞，又是一種抗感染的免疫細(xì)胞，它的正常功能狀態(tài)直接影響到分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)歸和結(jié)局。巨噬細(xì)胞凋亡在分枝桿菌感染的過程中是一種常發(fā)事件，現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)，分枝桿菌的多種分子可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的凋亡影響巨噬細(xì)胞的功能。一般認(rèn)為，分枝桿菌感染后，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡，通過形成凋亡小體，被活化的吞噬細(xì)胞吞噬消化有利于分枝桿菌的清除，這對于菌體抵抗分枝桿菌的感染有著重要作用。而有些致病力比較強(qiáng)的分枝桿菌，如MTB則通過它表達(dá)的分子抑制巨噬細(xì)胞凋亡過程，達(dá)到逃避免疫殺傷、潛伏的目的。相反，毒力弱的分枝桿菌如H37Ra、BCG等則常常促進(jìn)巨噬細(xì)胞的凋亡。

Zmp1由MTB的Rv0198c基因編碼，它是分枝桿菌的重要毒力分子，刪除zmp1基因的BCG對動物的免疫保護(hù)性增強(qiáng)。它可通過抑制caspase-1激活，抑制炎性復(fù)合體激活和炎性趨化因子白細(xì)胞介素1β(interleukin1β，IL-1β)分泌，阻止吞噬體活化成熟，進(jìn)而阻止吞噬溶酶體的結(jié)合和融合，影響后續(xù)的殺菌過程及特異性抗MTB免疫的激發(fā)。但它對巨噬細(xì)胞的增殖、凋亡的影響，尤其是巨噬細(xì)胞凋亡的影響還未見相關(guān)的報道。

因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計重組的Zmp1胞內(nèi)表達(dá)來觀察該分子是否對巨噬細(xì)胞的凋亡是否產(chǎn)生影響，以利于后續(xù)的功能研究。實(shí)驗(yàn)中我們選用的RAW264.7巨噬細(xì)胞，生長旺盛能連續(xù)穩(wěn)定分裂增殖，是研究巨噬細(xì)功能的常用細(xì)胞株。同時構(gòu)建的質(zhì)粒會表達(dá)綠色熒光蛋白，有利于我們的對蛋白表達(dá)的觀察。流式細(xì)胞術(shù)是檢測細(xì)胞凋亡的常用方法，我們采用annexinⅤ-PE和7-AAD來標(biāo)記Zmp1作用的巨噬細(xì)胞，通過流式細(xì)胞術(shù)來檢測細(xì)胞凋亡可了解Zmp1蛋白對細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，重組蛋白Zmp1胞內(nèi)表達(dá)可引起巨噬細(xì)胞早期凋亡率增高，這與Aguiló等的研究結(jié)論類似。本研究的結(jié)果為進(jìn)一步研究Zmp1蛋白通過何種機(jī)制導(dǎo)致巨噬細(xì)胞凋亡，對巨噬細(xì)胞的免疫功能產(chǎn)生何種影響的研究奠定了基礎(chǔ)。