血管發(fā)生或新生在胚胎器官的發(fā)育、出生后創(chuàng)面?zhèn)�口愈合及多種病理情況下都起著非常關(guān)鍵的作用。近年來研究表明，生長因子在細胞的增殖、遷移、損傷修復(fù)、潰瘍愈合及免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用，已有研究表明，肝細胞生長因子(hepatocytegrowthfactor，HGF)是一種多功能生物因子，具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖和新血管形成作用，還可促進組織細胞的再生、抑制細胞凋亡，可以調(diào)節(jié)炎癥、促進創(chuàng)傷愈合。胃潰瘍是一種常見消化道疾病，其病程常反復(fù)且遷延不愈，而上皮化和血管形成是胃潰瘍愈合必不可少的過程，因此，本研究依據(jù)胃潰瘍愈合過程原理，構(gòu)建了攜帶HGF基因真核表達載體的減毒的沙門菌菌株(TPH)，該菌株具有以下優(yōu)勢和特點：①采用的是基因治療方法，使局部轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的真核細胞作為一“微型藥物工廠”持續(xù)一定時間分泌表達HGF活性蛋白;②利用HGF的多功能修復(fù)作用，促血管形成;③減毒沙門菌是一良好的口服基因傳遞載體，對胃腸黏膜組織有親嗜作用，有望發(fā)展成一種口服基因治療藥物;④HGF已證明可抑制瘢痕，可減少愈合后的潰瘍瘢痕，可能阻止并發(fā)癥的發(fā)生。從而認(rèn)為該菌株可能具有促進胃潰瘍愈合的作用。

本文旨在探討構(gòu)建的TPH的促血管形成效應(yīng)，為其促進胃潰瘍創(chuàng)面愈合機制提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

人胎盤cDNA文庫、pSK購自美國Clontech公司;pEGFP-N1及pcDNA3為本室保存;瓊脂糖、Taq酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、核酸凝膠回收試劑盒均購自生工生物工程(上海)股份有限公司;酵母提取物及蛋白胨購自美國Merck公司;Ty21a菌株為軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈;人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)購自美國模式菌種收集中心(ATCC);DMEM和胎牛血清購自美國Gibco公司;抗人HGF單克隆抗體、重組人HGF蛋白純品購自美國R&D公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG購自美國SantaCruzBiotechnology公司;孵育第13天的雞胚購自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所;M450甲基纖維素購自美國Sigma公司;Multiporator4308型電轉(zhuǎn)儀購自德國Eppendorf公司。

1.2方法

1.2.1攜帶HGF基因減毒沙門菌菌株的構(gòu)建

1.2.1.1攜帶人HGF基因的真核表達載體

pcK-HGF的構(gòu)建按人HGFcDNA序列設(shè)計引物，正向引物序列為5'ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc3'，反向引物序列為5'tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt3'。從人胎盤cDNA文庫克隆人HGFcDNA(約2.2kb)。并將HGF基因的PCR產(chǎn)物克隆至pSK載體的BamHI和SalI酶切位點中，命名為pSK-HGF。將pcDNA3載體用SspI及AvrII雙酶切，回收大片段(約4.9kb)，pEGFP-N1用AvrII酶切，回收小片段(卡那霉素基因，1.1kb)，用T4DNA連接酶將回收的大小片段連接，獲得卡那霉素抗性的pcDNA3載體，以避免患者青霉素過敏，命名為pcK。分別用BamHI和ApaI雙酶切pcK及pSK-HGF，回收大片段及小片段，用T4DNA連接酶連接，獲得攜帶人HGF基因的含卡那霉素抗性基因的真核表達載體，命名為pcK-HGF。

1.2.1.2真核表達質(zhì)粒pcK-HGF電穿孔轉(zhuǎn)化減毒沙門菌將減毒沙門菌Ty21a接種于LB培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，低溫4000r/min離心收集菌體，用預(yù)冷的無菌去離子水洗滌細胞2次后重懸。用電轉(zhuǎn)儀將pcK-HGF和pcK質(zhì)粒各0.2μg轉(zhuǎn)入200μl預(yù)處理的Ty21a。37℃輕柔振蕩培養(yǎng)45min后涂布于含卡那霉素(100mg/L)固體LB培養(yǎng)基平皿繼續(xù)培養(yǎng)，次日挑取菌落進行鑒定。

1.2.1.3陽性工程菌的篩選從培養(yǎng)板挑取單菌落分別接種于含卡那霉素LB培養(yǎng)液中，37℃振搖培養(yǎng)。轉(zhuǎn)入pcK-HGF的減毒沙門菌陽性菌株的篩選通過卡那霉素抗性、PCR(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV及目的基因HGF)及提取質(zhì)粒后BamHI/ApaI雙酶切鑒定;轉(zhuǎn)入pcK的減毒沙門菌菌株的篩選通過卡那霉素抗性及PCR篩選(利用菌液為模板，擴增真核表達啟動子CMV)。CMV擴增引物：5'cccagtacatgaccttatggg3'，5'ggagacttggaaatccccgt3'。HGF擴增引物：5'ccatcgatgttaacatgtgggtgaccaaactc3'，5'tgggatccgcggccgcctatgactgtggtacctt3'。

1.2.2重組減毒沙門菌活性觀察

1.2.2.1重組減毒沙門菌轉(zhuǎn)染HUVEC將HUVEC接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔6×105個細胞，次日用無抗生素DMEM培養(yǎng)液洗滌細胞2次，分別將1×108cfu攜帶pcK和攜帶pcK-HGF質(zhì)粒的減毒沙門菌加入HUVEC細胞中，37℃共孵育30min，用含慶大霉素(50mg/L)的無血清培養(yǎng)基洗滌細胞后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃孵育4h后加入四環(huán)素至終濃度為10mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)48h收集細胞上清，用雙抗夾心ELISA法檢測上清中HGF的表達水平。一抗為抗人HGF單克隆抗體(1mg/ml)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG，用新鮮配制的OPD底物顯色液顯色，同時用重組人HGF標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以計算上清中HGF的表達量。

1.2.2.2HGF表達上清對HUVEC的作用分析采用MTT法測定細胞增殖活性。將HUVEC接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔細胞數(shù)5×103個。12h后吸棄原培養(yǎng)液，每孔加入100ml無血清DMEM，HGF表達上清所加的量分別含HGF100、200、400、800、1600pg。72h后每孔加入20mlMTT，37℃孵育4h后，棄上清，用DMSO溶解沉淀，測其在560nm波長處吸光度(A)。

1.2.2.3HGF表達上清對雞胚絨膜尿囊膜血管刺激作用觀察采用我們前期報道的實驗方法制備甲基纖維素碟。實驗分三組：轉(zhuǎn)染攜帶pcK-HGF質(zhì)粒的減毒沙門菌的HUVEC細胞上清組(HGF表達產(chǎn)物800pg)、轉(zhuǎn)染攜帶pcK質(zhì)粒的減毒沙門菌的HUVEC細胞上清組(同體積上清)及對照組(同體積轉(zhuǎn)染PBS的HUVEC細胞上清)，分別將三組上清加入甲基纖維素碟內(nèi)，每組6胚，按操作程序進行下一步實驗操作。之后按文獻方法計數(shù)每組以甲基纖維素碟為中心周圍1cm2輻射出新生小血管的數(shù)量。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，所有數(shù)據(jù)采用SPSS10.0版軟件的單因素方差分析，t檢驗進行均數(shù)兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1攜帶HGF基因減毒沙門菌菌株TPH的構(gòu)建

2.1.1HGF表達質(zhì)粒的鑒定對PCR所得HGFcDNA測序結(jié)果表明，其序列與GenBank已公布的人HGFcDNA序列(M60718.1)完全一致�？寺≈琳婧吮磉_載體pcK后采用限制性內(nèi)切酶及抗生素抗性鑒定。用BamHI和ApaI雙酶切后可在瓊脂糖凝膠電泳圖上見一約2.2kb的DNA片段，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后可在含卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)板上生長轉(zhuǎn)化子克隆。表明我們成功構(gòu)建了HGF的表達質(zhì)粒pcK-HGF。

2.1.2陽性工程菌的篩選工程菌可在含卡那霉素的LB瓊脂平板上生長，從單克隆中PCR可擴增出真核表達啟動子CMV和目的基因HGF，提取質(zhì)粒用BamHI/ApaI雙酶切后，在電泳圖上可見一約2.2kb的DNA片段，表明pcKH已成功轉(zhuǎn)入減毒沙門菌菌株，命名為TPH。

2.2TPH轉(zhuǎn)染HUVEC后HGF的表達及對HUVEC細胞的增殖刺激活性1×108cfuTPH轉(zhuǎn)染HUVEC細胞48h后，用雙抗夾心ELISA方法檢測上清中HGF的表達。結(jié)果表明，6×105個HUVEC細胞可表達160~190ng的HGF蛋白。采用MTT法分析了含不同劑量HGF表達上清對HUVEC細胞的作用，結(jié)果表明，含HGF表達上清有明顯刺激HUVEC增殖的活性(P<0.05)，而且具有劑量-效應(yīng)關(guān)系。加入800pg表達上清時刺激活性達高峰，劑量加大活性不再明顯增加。

2.3細胞表達上清對雞胚絨膜尿囊膜血管刺激作用置入含細胞表達上清的甲基纖維素碟后，雞胚絨膜尿囊膜(chickenchorioallantoicmembrane，CAM)繼續(xù)孵育3d，之后將雞胚絨膜尿囊膜固定后取出，以小碟為中心計數(shù)小血管數(shù)。結(jié)果對照組在小碟周圍觀察到較弱的生血管效應(yīng)，轉(zhuǎn)染TP的HUVEC細胞上清組觀察到較明顯的小血管增多現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染TPH的HUVEC細胞上清組(HGF表達產(chǎn)物800pg)以小碟為中心觀察到明顯的毛刷樣小血管形成，轉(zhuǎn)染TPH的HUVEC細胞上清組血管數(shù)量為(133.0±11.5)/cm2，明顯大于轉(zhuǎn)染TP的HUVEC細胞上清組(83.3±5.5)/cm2和對照組(62.7±7.1)/cm2(P<0.05)。

3討論

HGF最初是從血漿和血小板中純化獲得并認(rèn)為是一種刺激肝細胞增生的有絲分裂原，對肝切除或化學(xué)損傷后的肝再生起重要作用。目前，已知HGF主要來源于內(nèi)皮細胞、成纖維細胞、脂肪細胞等間質(zhì)細胞，由前體蛋白(Pro-HGF)經(jīng)剪切、糖基化等翻譯加工合成，由69kD的α亞基和34kD的β亞基組成的異二聚體。HGF受體為C-met癌基因編碼的蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)上屬于11型酪氨酸激酶受體，具有細胞外結(jié)合、跨膜和細胞內(nèi)激酶區(qū)域。

HGF的作用是通過與其受體結(jié)合而實現(xiàn)的。HGF作用于多種類型的細胞，具有多樣的生物學(xué)作用。它可刺激細胞增殖，修復(fù)組織器官的損傷，發(fā)揮有絲分裂原的作用，可促進胚胎的發(fā)育及各類組織器官的形態(tài)發(fā)生，發(fā)揮形態(tài)發(fā)生原的作用，它還可促進細胞的遷移和侵襲，對某些組織的形成和發(fā)育及腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲具有重要意義。已有許多研究表明HGF能促進內(nèi)皮細胞增殖遷移，促進損傷局部血管形成。血管發(fā)生的研究起初是用于腫瘤血管發(fā)生機制的探討，之后研究領(lǐng)域漸漸擴大，如血管的發(fā)育來源、血管發(fā)生的分子特性及基因調(diào)控、腫瘤的診斷治療、缺血性疾病的治療和創(chuàng)面愈合等，也用于篩選治療缺血性疾病、促進傷口愈合和抗腫瘤的藥物。顯微水平血管研究實驗?zāi)Ｐ投嘤檬蠡蛲媒悄ず虲AM，本研究我們選擇了CAM作為體內(nèi)TPH促血管形成治療潰瘍愈合潛能的模型，CAM是雞胚發(fā)育第4天由體中胚層和臟壁中胚層融合而成的富含血管的膜，由內(nèi)向外由內(nèi)皮細胞層、大血管層、毛細血管篩層3層組成，負(fù)責(zé)血氣交換。因CAM容易獲得且此模型操作簡單、快速、經(jīng)濟、有效，多用于血管形成效應(yīng)研究。

本實驗結(jié)果表明對照組在小碟周圍觀察到較弱的生血管效應(yīng)，轉(zhuǎn)染TP的HUVEC細胞上清組觀察到較明顯的小血管增多現(xiàn)象，轉(zhuǎn)染TPH的HUVEC細胞上清組以小碟為中心觀察到明顯的毛刷樣小血管形成，通過定量計數(shù)轉(zhuǎn)染TPH的HUVEC細胞上清組血管數(shù)量明顯大于轉(zhuǎn)染TP的HUVEC細胞上清組和對照組(P<0.05)。在組織損傷再修復(fù)中，上皮和間質(zhì)間存在極為重要的信息交換，HGF是機體間質(zhì)和上皮信息交換分子。在胃潰瘍愈合過程中，HGF和c-met受體表達增加，醋酸型潰瘍主要是由于醋酸直接損傷胃壁組織，引起局部血循環(huán)障礙而造成的，Brozowski等研究認(rèn)為用HGF治療胃潰瘍能通過影響COX-2的表達和胃黏膜血流而加速潰瘍愈合。大鼠胃黏膜HGFmRNA分布于再生腺體與黏膜下組織動脈血管之間的基質(zhì)細胞中，其受體c-metmRNA則位于再生腺體上皮細胞，HGF能使正常大鼠胃黏膜上皮細胞環(huán)氧化酶-2mRNA和蛋白表達分別增加至236%和175%。環(huán)氧化酶-2系前列腺素合酶，能促進前列腺素的合成，而前列腺素對胃黏膜細胞具有保護作用，能增加黏膜的血液循環(huán)，HGF也可能通過增加前列腺素合成促進胃潰瘍的愈合。

由此可見，我們構(gòu)建的攜帶HGF基因的減毒沙門菌TPH有潛在治療胃潰瘍的作用，其體內(nèi)防治胃潰瘍的效果有待進一步研究。本研究所選用的減毒沙門菌株Ty21a是由Germanier于1975年將其野型株Ty2經(jīng)化學(xué)突變劑亞硝基胍處理而獲得的突變株，是目前用于人群預(yù)防的減毒疫苗株。研究中我們利用減毒沙門菌作為基因傳遞載體的優(yōu)勢，用Ty21a作為載體將HGF基因攜帶至損傷創(chuàng)面局部，使局部轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞作為一“微型藥物工廠”持續(xù)一定時間分泌表達HGF活性蛋白而發(fā)揮其多功能生物作用。由于HGF蛋白半衰期極短，容易降解，給藥不方便，而且成本高;培養(yǎng)攜帶HGF基因的減毒鼠傷寒沙門菌成本低，繁殖快;而編碼外源基因的真核質(zhì)粒遞呈入抗原提呈細胞，外源基因在其中表達并持續(xù)釋放，從而達到基因治療疾病的目的。

綜上所述，本實驗通過構(gòu)建攜帶肝細胞生長因子基因真核表達載體的減毒沙門菌菌株TPH，體外觀察TPH在HUVEC中的表達情況，然后探討目的基因表達上清對HUVEC的增殖活性，并評價表達上清對雞胚絨膜尿囊膜血管生成效應(yīng)的刺激效應(yīng)，目的是評價攜帶HGF基因的減毒沙門菌株TPH是否在組織創(chuàng)面愈合中通過促進血管形成而起促愈合作用。本實驗結(jié)果提示，TPH可能在潰瘍治療中有潛在的應(yīng)用價值。