腺病毒(adenovirus，Adv)是一種無囊膜的雙鏈DNA 病毒，基因組大小約為36kb。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)的人腺病毒有100多種血清型，其中用于人類腫瘤基因治療的多為人5型腺病毒�；�因治療因可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞表型或誘導(dǎo)細(xì)胞自我毀滅而備受關(guān)注，病毒療法為其中的主要領(lǐng)域。

RAPAd.Ⅰ腺病毒載體系統(tǒng)可用于構(gòu)建重組腺病毒，該載體缺失腺病毒基因組骨架的左臂反向末端重復(fù)區(qū)(ITR)、包裝信號及早期區(qū)1基因(E1)，最大程度地降低包裝過程中野生型腺病毒的污染。病毒所攜帶的目的基因-凋亡素是一種小分子蛋白，來源于雞貧血病病毒，能夠通過誘導(dǎo)凋亡特異性殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常細(xì)胞幾乎沒有殺傷作用。PEG3是一種有效的腫瘤標(biāo)志物，在腫瘤的發(fā)展和DNA 損傷中高度表達(dá)，具有致瘤性和促進(jìn)血管發(fā)生的作用，在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，進(jìn)行性增量基因3(PFG3)啟動子(progression-elevated　genes　3promoter，PEG3p)具有良好的腫瘤特異性。本研究擬利用RAPAd.Ⅰ腺病毒載體系統(tǒng)，結(jié)合Apoptin和PEG3p，構(gòu)建具有腫瘤特異性殺傷和復(fù)制功能的雙特異性溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a，為進(jìn)一步探討其腫瘤生物治療用途奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1　材料

大腸埃希菌E.coli　DH5α感受態(tài)，人胚胎腎細(xì)胞(HEK293)，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞(A549)，人正常肝細(xì)胞(L02)，質(zhì)粒pMT-E1a、pIRES-neo、pKS-PEG3p、pAd-Apoptin、pAd5均由本實(shí)驗室保存;RNA 提取試劑盒購自寶生物(大連)公司;脂質(zhì)體X-tremeGENEHP購自瑞士ROCHe公司，3-(4，5-二甲噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTS)購自美國Promega公司。

2　方法

2.1　細(xì)胞培養(yǎng)

HEK293細(xì)胞在DMEM(10%胎牛血清，100U/L青霉素，100U/L鏈霉素)中于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用2.5g/L胰蛋白酶消化后制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.5×105個/ml，接種于六孔板(每孔2ml)，培養(yǎng)12h～24h后用于轉(zhuǎn)染。

2.2　穿梭質(zhì)粒構(gòu)建

用PstⅠ和BumHⅠ雙酶切質(zhì)粒pMT-E1a，獲得目的片段E1a，與經(jīng)同樣雙酶切的pKS-PEG3p 連接，構(gòu)建質(zhì)粒pSK-PEG3p-E1a。用XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切質(zhì)粒pIRES-neo，獲得PolyA核苷酸片段，補(bǔ)平后與經(jīng)HindⅢ酶切并補(bǔ)平的pSKPEG3p-E1a連接，構(gòu)建質(zhì)粒pSK-PolyA-PEG3p-E1a。用BumHⅠ酶切pAd-Apoptin，補(bǔ)平后再用SpeⅠ酶切，回收線性化的pAd-Apoptin。用XhoⅠ酶切pSKPolyA-PEG3p-E1a，補(bǔ)平后再用SpeⅠ酶切，獲得目的基因-PolyA-PEG3p-E1a，將其與線性化的pAd-Apoptin連接，構(gòu)建質(zhì)粒pacAd-PEG3p-E1a-Apoptin。

2.3　重組腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a的包裝

用PacⅠ單酶切pacAd-PEG3p-E1a-Apoptin和腺病毒骨架質(zhì)粒(pAd5)進(jìn)行線性化處理，酶切產(chǎn)物用無水乙醇沉淀回收，并將線性化質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)7～10d待病毒復(fù)制到一定程度時收集并反復(fù)凍融3次，然后重新接種HEK293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的病毒進(jìn)行RT-PCR、Western　blot和電鏡鑒定。

2.4　RT-PCR 檢測

培養(yǎng)接種重組腺病毒的HEK293細(xì)胞至80%～90%病變時提取病毒總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后以3μl　cDNA為模板，以Apoptin、E1a特異引物進(jìn)行RT-PCR。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系：12.5μl　2×Mix　buffer，上、下游引物各0.3μl，補(bǔ)加雙蒸水至25μl。反應(yīng)條件：95℃3min;94℃30s，57℃30s，72℃30s，共30個循環(huán);72℃延伸10min。

2.5　Western　blot檢測

培養(yǎng)接種重組腺病毒的HEK293、A549細(xì)胞至80%～90%病變時收獲細(xì)胞，按文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行Western　blot實(shí)驗，五磷體檢測以山羊源多克隆抗體(5%脫脂乳1000倍稀釋)為一抗，二抗為鼠抗羊IgG-HRP(PBS800倍稀釋);E1a檢測以兔源多克隆抗體(5%脫脂乳1　000倍稀釋)為一抗，二抗為羊抗兔IgG-HRP(PBS800倍稀釋)。

2.6　電子顯微鏡觀察重組腺病毒形態(tài)

將重組腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a接種于HEK293細(xì)胞，48h后刮去細(xì)胞，超聲破碎，以3　000r/min(離心半徑6.9cm)離心10min，取上清液進(jìn)行負(fù)染，電鏡下觀察病毒形態(tài)。

2.7　MTS法檢測抑瘤率

于96孔板制備A549單層細(xì)胞(5×103 個/孔)，利用不同程度感染復(fù)數(shù)(1、10、100MOI)的Ad-Apoptin-PEG3p-E1a、Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock分別感染24、48、72和96h，每組設(shè)4個復(fù)孔。L02細(xì)胞經(jīng)同樣處理作為對照。于培養(yǎng)結(jié)束前，每孔加入20μl　MTS液37℃繼續(xù)培養(yǎng)1h，用酶標(biāo)儀(TECAN公司生產(chǎn))在492nm下測定吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(對照孔A值-實(shí)驗孔A值)/對照孔A值]×100%。

2.8　繪制重組腺病毒一步生長曲線

用六孔板培養(yǎng)HEK293細(xì)胞(每孔1×106 個)，12h～24h后接種100MOI　Ad-Apoptin-PEG3p-E1a，分別于感染后第12、24、48、96h收獲細(xì)胞，超聲破碎后在HEK293細(xì)胞上測定病毒滴度，計算每毫升病毒液中所含空斑形成單位(PFU)。PFU/ml=(病毒空斑數(shù)× 稀釋倍數(shù))/接種體積。

結(jié)　果

1　質(zhì)粒pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a的構(gòu)建

用EcoRⅠ和BumHⅠ雙酶切質(zhì)粒pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a，酶切片段大小分別為6　637bp 和1　833bp，與預(yù)期相符，質(zhì)粒pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a構(gòu)建成功。

2　重組腺病毒的包裝

線性化的質(zhì)粒pacAd-Apoptin-PEG3p-E1a 和pAd5共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)約10d可見到明顯噬斑，表明包裝出病毒。

3　重組腺病毒的Western　blot鑒定

重組腺病毒轉(zhuǎn)染HEK293 細(xì)胞后進(jìn)行培養(yǎng)，Western　blot檢測在分子質(zhì)量單位為108ku處出現(xiàn)特異性條帶，與五磷體陽性對照一致，該重組病毒表達(dá)五磷體(為腺病毒蛋白)，即該病毒為腺病毒。

4　重組腺病毒形態(tài)

電鏡下觀察重組病毒無囊膜，衣殼呈二十面體立體對稱，每面呈正三角形，為腺病毒典型形態(tài)。

5　重組病毒攜帶目的基因的Western　blot鑒定

重組腺病毒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后連續(xù)培養(yǎng)，Westernblot檢測出現(xiàn)分子質(zhì)量單位為50ku的反應(yīng)條帶，與E1a陽性對照一致，表明包裝出的腺病毒攜帶目的基因E1a并表達(dá)E1a蛋白。

6　重組腺病毒的RT-PCR鑒定

對重組腺病毒感染的HEK293細(xì)胞的RNA進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增出于Apoptin同等大小的目的基因，表明目的基因Apoptin整合入腺病毒基因組。

7　重組腺病毒的抑瘤率檢測

MTS檢測顯示，重組腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a有明顯的抑瘤作用，且抑瘤效果顯著強(qiáng)于Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Ad-mock。在感染時間相同的條件下，隨感染劑量的增加，Ad-Apoptin-PEG3p-E1a對A549細(xì)胞的抑制率明顯增加，具有量效關(guān)系(用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05);在感染劑量一定的條件下(100MOI)，隨感染時間的延長Ad-Apoptin-PEG3p-E1a對A549細(xì)胞的抑制率明顯增加，具有時間效應(yīng)關(guān)系(用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，P <0.05)。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a 對A549細(xì)胞的抑制作用在100MOI、96h達(dá)峰值，為(79.84±1.0)%，Ad-PEG3p-E1a、Ad-Apoptin、Admock分別為(69.19±2.70)%，(17.47±5.05)%，(13.74±6.02)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05)。Ad-Apoptin-PEG3p-E1a對正常L02細(xì)胞的增殖無明顯影響。

8　Ad-Apoptin-PEG3p-E1a一步生長曲線

重組腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a感染A549、L02細(xì)胞后，分別在不同時間收集病毒液，測定病毒滴度，表明該重組腺病毒具有正常復(fù)制能力。

討　論

隨著人們對腫瘤發(fā)生發(fā)展機(jī)制認(rèn)識的不斷深入，基因療法成為攻克惡性腫瘤最有希望的治療手段，其中基于溶瘤腺病毒的腫瘤基因治療更是研究焦點(diǎn)。本研究采用RAPAd.Ⅰ系統(tǒng)對重組腺病毒進(jìn)行構(gòu)建，該系統(tǒng)為避免野生型腺病毒的污染將病毒復(fù)制與包裝相關(guān)信號序列從腺病毒基因組骨架質(zhì)粒中剔除，并將其轉(zhuǎn)移至穿梭質(zhì)粒中，這樣只有當(dāng)腺病毒骨架質(zhì)粒與穿梭質(zhì)粒重組后才能使病毒包裝和復(fù)制。

Apoptin因能誘導(dǎo)人腫瘤細(xì)胞凋亡而被命名為凋亡素。Apoptin引起的細(xì)胞凋亡不依賴抑瘤基因p53的介導(dǎo)，不受抗凋亡因子Bcl-2的抑制，也不依賴死亡因子，但Apoptin引起的細(xì)胞死亡很大程度上受線粒體途徑的監(jiān)督。Apoptin在正常細(xì)胞中位于細(xì)胞質(zhì)，而在腫瘤細(xì)胞中位于細(xì)胞核，這種細(xì)胞核定位與Apoptin的腫瘤特異性凋亡作用密切相關(guān)。實(shí)驗證明，Apoptin具有廣譜的腫瘤凋亡效應(yīng)，而對正常細(xì)胞無毒性。Apoptin針對腫瘤具有特異性凋亡作用，其機(jī)制較明確，有望解決腫瘤基因治療過程中高效性和特異性難于統(tǒng)一或易于產(chǎn)生耐藥性的問題。

PEG3p是PEG 啟動子的最小功能單位，腫瘤細(xì)胞中存在大量的PEG3p轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)PEA-3、AP-1，而這兩種轉(zhuǎn)錄因子在正常細(xì)胞中未能檢測到，因而增強(qiáng)了PEG3p的腫瘤選擇性。陳智飛等的研究顯示PEG3對結(jié)直腸癌有靶向作用。Madireddi等研究發(fā)現(xiàn)PEG3對乳腺癌有靶向作用。Fisher等報道PEG3p其對惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞，惡性黑色素瘤細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞也有同樣的靶向表達(dá)作用。PEG3p的這種在腫瘤細(xì)胞中選擇性驅(qū)動靶基因表達(dá)的特性將被廣泛應(yīng)用于人類腫瘤的基因治療。

本研究構(gòu)建了腫瘤特異性殺傷和復(fù)制型腺病毒，病毒基因組中巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus，CMV)啟動子在上游驅(qū)動特異性抑瘤基因Apoptin，使病毒具有特異性溶瘤作用，PEG3p在下游驅(qū)動腺病毒5型早期區(qū)1A基因(eraly　region　1A，E1a)，使病毒能夠特異性復(fù)制，這樣重組腺病毒Ad-Apoptin-PEG3p-E1a具有了特異性殺傷和特異性復(fù)制的雙特異性溶瘤作用，經(jīng)MTS檢測有對腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷和特異性復(fù)制作用。

惡性腫瘤的治療以手術(shù)、化療和放療為主，但傳統(tǒng)療法副作用大且對腫瘤的特異性低，隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)及免疫學(xué)的滲透和發(fā)展，基因療法有望成為具有特異性和有效性的腫瘤治療新途徑。MTS檢測表明，本研究構(gòu)建的重組腺病毒對腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用，具有臨床開發(fā)潛質(zhì)。