γδT 細胞是一群橋接固有免疫和適應性免疫的獨特T 淋巴細胞亞群，約占外周淋巴細胞的0.5%~5%，在機體抗感染和抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，γδT細胞在難治性前列腺癌、腎癌、非小細胞肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、轉移性黑色素瘤、白血病和淋巴瘤的臨床治療中總客觀應答率達40%，其中難治性前列腺癌和腎癌的客觀應答率優(yōu)于二線化療藥。雖然取得了很好的臨床效應，但缺乏一種準確、簡單、經(jīng)濟的方法評估其殺傷效應，該方法的建立對推進免疫細胞臨床應用標準化質量體系的建設具有重要意義。免疫細胞細胞毒活性經(jīng)典的檢測方法是51Cr釋放法，由于放射性元素污染，極大地限制了該方法的應用。其它檢測方法如MTT法、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，存在靈敏度不高、操作繁瑣的缺點。最近研究發(fā)現(xiàn)，用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)染色效應細胞，檢測前用碘化丙啶(propidium iodide，PI)對死亡細胞染色，最后用流式細胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測，具有與51Cr 釋放法相當?shù)臏蚀_性。然而經(jīng)典方法無法區(qū)分死亡細胞的來源：即來源于免疫細胞介導的殺傷還是自然死亡。因此我們通過實驗，建立并優(yōu)化了Calcein-AM/PI 雙標法結合流式細胞術檢測γδT細胞殺傷性的方法，解決了上述方法的不足。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Calcein-AM 購自Invitrogen，PI、HMBPP 購自Sigma，RPMI 1640、胎牛血清(FBS)購自Gibco，重組人IL-2(rhIL-2)購自北京雙鷺，硫酸慶大霉素購自宜昌人福藥業(yè)，人淋巴細胞分離液購自天津灝洋。抗CD3-FITC、抗CD3- PerCP、抗CD4-PE、抗CD8-PE、抗TCRVγ9-PE 熒光抗體和Trucount管購自BD。流式細胞儀FACSCanto II和Z2全自動細胞分析計數(shù)儀分別購自BD和Beckman。

1.2 標本來源和γδT細胞培養(yǎng)

采集健康成年志愿者外周靜脈血，肝素抗凝，生理鹽水等體積稀釋后，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離獲取外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs);充分洗滌后調整細胞數(shù)為1×106/ml，重懸于含5% FBS、5%人自體血漿和80 IU/ml硫酸慶大霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。接種于T25培養(yǎng)瓶，每瓶5 ml，同時加入HMBPP和rhIL-2，終質量濃度均為20 ng/ml，根據(jù)細胞生長情況每2~3天進行補液或傳代，補液使用含有300 IU/ml rhIL-2的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，補液后細胞數(shù)維持在(0.5~1)×106 /ml，培養(yǎng)至7~10 d收集細胞，經(jīng)上述條件處理可獲得γδT細胞。腫瘤細胞株K562 和A549 均購自中國科學院上海細胞庫，用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

1.3 Calcein-AM 標記靶細胞Calcein-AM 以二甲基亞砜(DMSO)配制成儲存液(2 mmol/L)，分裝后-20 ℃ 保存。不同的腫瘤細胞有不同的染色條件，為了確定染色條件，取對數(shù)生長期的K562、A549細胞，PBS洗滌2 次后調整細胞數(shù)為4×106/ml，添加于24孔板，每孔1 ml;將倍比稀釋的Calcein-AM加入上述細胞孔，終濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0 625、0.0 313、0.0 156、0.0 078 μmol/L，每一梯度設3個復孔，然后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內孵育30 min;孵育結束后，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌2次，制備成1×105/ml細胞懸液，分別于0、4和24 h上機檢測MFI值。固定Calcein-AM濃度為0.5 μmol/L，調整細胞數(shù)分別為5×104/ml、1×105/ml、2×105/ml、4×105/ml、8×105/ml、1.6×106/ml、3.2×106/ml、6.4×106 /ml、1.28×107/ml，然后按照上述步驟進行染色、洗滌和檢測MFI值。

1.4 細胞收集、PI 染色和流式檢測標準操作程序將Calcein-AM 標記好的腫瘤細胞與γδT細胞按1∶10的比例制備成細胞數(shù)分別為1×105/ml、1×106/ml的混合細胞懸液，加入24孔培養(yǎng)板，1 ml/孔;同時設置陰性對照組，含1×105 /ml Calcein-AM 標記的腫瘤細胞，1 ml/孔。每組均設置3 個復孔，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內共孵育30 min。孵育結束后，取出細胞充分重懸后移入2 ml EP 管內，然后用PBS 洗滌1 次，洗滌液移入對應EP管內，并用PBS調整每管的體積為2 ml。上述細胞懸液充分重懸后取450 μl于新的EP管內，加入終質量濃度為5 μg/ml的PI 染色，避光、冰浴20 min 后移入經(jīng)抗CD3-FITC、抗CD4-PE 同型對照抗體染色的體積為500 μl 的絕對計數(shù)管內。上機檢測，按固定體積100 μl 收集計數(shù)。

1.5 γδT細胞介導的細胞毒效應檢測Calcein-AM標記好的腫瘤細胞(K562、A549)，2×105/ml，0.5 ml/孔加入24孔培養(yǎng)板，然后按照不同的效靶比(5∶1、10∶1 和20∶1)將γδT細胞加入上述培養(yǎng)板孔內，最后用完全RPMI 1640培養(yǎng)基補充至1 ml/孔;同時設置陰性對照組，含1×105 /ml Calcein-AM 標記的K562和A549 細胞，體積為1 ml，每組均設置3 個復孔，于37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱內共孵育24 h。按照1.4 操作程序，進行細胞收集、PI 染色和流式檢測，最后用FlowJo 軟件對結果進行分析，γδT細胞殺傷率計算公式為：1-實驗組Calcein-AM 單陽性細胞數(shù)/對照組Calcein-AM單陽性細胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差，采用t 檢驗、單因素方差分析或簡單線性回歸分析完成相關數(shù)據(jù)分析。P<0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Calcein-AM 工作濃度與靶細胞密度相關性分析流式檢測不同Calcein-AM 濃度對腫瘤細胞(K562、A549)染色平均熒光強度(mean fluorescenceintensity，MFI)的影響。結果顯示，A549和K562在不同濃度Calcein-AM標記的腫瘤細胞均能顯示一個單一的峰值，MFI隨Calcein-AM 濃度升高而增強。進一步簡單線性回歸分析顯示，A549和K562的MFI 與Calcein-AM 濃度呈線性正相關(R2 =0.971 0，P<0.000 1)。在此基礎上，我們進一步探討了Calcein-AM標記的腫瘤細胞與細胞密度的相關性。Calcein-AM的工作濃度為0.5 μmol/L，以K562為例，設定K562細胞數(shù)分別為5×104/ml、1×105/ml、2×105/ml、4×105/ml、8×105/ml、1.6×106/ml、3.2×106/ml、6.4×106/ml、1.28×107/ml。結果顯示，Calcein-AM 對不同細胞數(shù)K562 也均顯示一個單一的峰值，不同的是MFI 隨K562密度的增加而降低。簡單線性回歸分析顯示，MFI與K562密度呈線性負相關(R2= 0.476 7，P<0.000 1)。

2.2 靶細胞平均熒光強度時間動力學變化特征性分析為了研究Calcein-AM標記的K562 MFI 是否隨時間變化，將染色的K562分別0、4和24 h上流式檢測。結果顯示，隨著染色時間延長MFI逐漸降低，3組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。此外，我們還檢測了Calcein-AM染色對細胞活率是否產(chǎn)生影響，利用PI檢測實驗組與對照組細胞死亡比例。結果顯示，與對照組相比，死亡率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.3 流式細胞儀計數(shù)準確性和穩(wěn)定性分析在上述實驗的基礎上，我們應用抗CD3-PerCP 和抗CD4-PE的同型對照抗體對標準磁珠進行染色，絕對計數(shù)管原理是計數(shù)管的Beads數(shù)量是已知，當固定上樣體積時，即可知Beads的濃度。流式可以記錄顆粒數(shù)，上樣后機器根據(jù)顆粒數(shù)量算上體積，從而計算出樣本的濃度，進一步對流式收集細胞過程的穩(wěn)定性和計數(shù)的準確性進行驗證。結果顯示，標準磁珠和Calcein-AM 標記的活細胞群分群明顯，經(jīng)BD絕對計數(shù)管計數(shù)和給定值之間差異無統(tǒng)計學意義(47 200±208 vs 47 150，P=0.324>0.05)。同時，經(jīng)孵育30 min的實驗組和對照組Calcein-AM 標記的腫瘤細胞絕對計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(98 642±876 vs 98 692±769，P=0.698 7>0.05)。

2.4 γδT 細胞對Calcein-AM標記靶細胞殺傷功能檢測利用上述優(yōu)化條件，我們評估了不同效靶比下，γδT細胞與K562和A549細胞共孵育24 h的殺傷活性。結果顯示，效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1條件下，K562 殺傷率分別為0.63±0.02、0.84±0.02、0.91±0.02，與5∶1組相比，10∶1、20∶1組殺傷率明顯提高(P<0.01)，但是10∶1和20∶1組之間殺傷率無統(tǒng)計學意義(圖4);A549殺傷率分別為0.38±0.02、0.5± 0.02、0.65±0.02，與5∶1組相比，10∶1、20∶1組殺傷率明顯提高(P<0.01)，但是10∶1和20∶1組之間殺傷率無統(tǒng)計學意義。因為不同的腫瘤細胞，γδT的殺傷有不同的結果，從上述結果來看，對血液瘤的殺傷率就比實體瘤的要高。

3 討論

近年來，以免疫細胞為基礎的腫瘤免疫治療在臨床應用中取得了巨大進展。如何通過一種簡單的方式、準確評價其細胞毒活性，則對免疫細胞臨床應用質量檢測標準化體系的建設相當重要。測定免疫細胞細胞毒活性最經(jīng)典的方法是51Cr 釋放法。該方法準確且重復性好，但存在很多不足，如51Cr本身的放射性污染、自發(fā)釋放率高以及檢測需要大量的免疫細胞等內在缺陷，使其應用受到了極大限制。目前產(chǎn)生了很多51Cr釋放法替代性方法，其中基于流式細胞術的Calcein-AM/PI雙染法取得了很好的效果。Jang 等報道采用Calcein-AM對NK細胞染色檢測其細胞毒活性，流式檢測前用PI染色，結果與51Cr釋放法檢測近似。該方法直接通過死亡細胞占總靶細胞的百分比來計算殺傷效應，無法區(qū)分死亡細胞是自然死亡還是NK細胞介導的殺傷性死亡。因此，該方法尚存在一定的局限性。

本研究成功建立并優(yōu)化了基于流式細胞術的Calcein-AM/PI雙染法檢測γδT細胞殺傷效應。選擇K562和A549作為靶細胞，首先確定了Calcein-AM工作濃度和靶細胞密度，在0.1~0.5 μmol/L的濃度范圍內有很好的線性關系，濃度為0.5 μmol/L時，靶細胞有較寬的密度范圍選擇。因此，本實驗為應用Calcein-AM進行不同密度靶細胞染色提供了參考。接著研究時間對靶細胞MFI變化以及Calcein-AM對靶細胞存活的影響，發(fā)現(xiàn)MFI隨時間延長而降低，而染料本身對細胞存活無明顯影響，這與以前的報道相一致[16, 19]。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，通過優(yōu)化染料濃度和靶細胞密度，染色24 h后還能很好的與未染細胞區(qū)分，較Cholujova等染色后需3~4 h內檢測，時間有明顯延長[19]。因此通過本優(yōu)化方案，可以使效靶細胞共孵育時間延長到24 h，從而更加有效的反應效應細胞對靶細胞的殺傷效應。另外，本研究通過BD絕對計數(shù)管驗證了流式操作過程的穩(wěn)定性和準確性，絕對計數(shù)管原理是：根據(jù)計數(shù)管已知的Beads數(shù)量，當固定上樣體積時，即可知Beads的濃度。流式可以記錄細胞的顆粒數(shù)，上樣后機器根據(jù)顆粒數(shù)量和體積，從而計算出樣本的濃度，進一步對流式收集細胞過程的穩(wěn)定性和計數(shù)的準確性進行驗證。本實驗選擇染色后30 min檢測對腫瘤細胞計數(shù)，是因為30 min細胞能夠很好的貼壁，同時對靶細胞的殺傷效應還未顯示。因此能夠很好的模擬效靶細胞共孵育更長時間的貼壁狀態(tài)，從而更好的驗證收集、PI染色和上流式操作的程序。

最后在上述優(yōu)化的條件下，檢測了誘導培養(yǎng)第10 天γδT 細胞對K562 和A549 細胞的殺傷效應。γδT細胞是PBMCs經(jīng)HMBPP和rhIL-2聯(lián)合誘導培養(yǎng)的一群以Vγ9Vδ2 T細胞為主的細胞群，增殖力高達1 000倍(數(shù)據(jù)未顯示)。流式檢測后，通過先計算靶細胞存活率，然后用“1-存活率”的方法間接計算其殺傷率，發(fā)現(xiàn)共孵育24 h，不同的腫瘤細胞有不同的殺傷效率，對于K562細胞，當效靶比為5∶1時即可檢測到明顯的殺傷效應，10∶1時，殺傷率就高達90%以上，而對于A549細胞，當效靶比為5∶1時殺傷率為38%，10∶1，20∶1是額殺傷分別達50%和60%以上(圖4、5)。因此我們建立一種高效擴增、并具有高細胞毒活性的γδT 細胞培養(yǎng)方案;通過本方法能夠很好的對其細胞毒活性進行檢測。由于使用對照的方式排除了反應過程中自然死亡細胞，因此更能真實反應γδT細胞的細胞毒活性。同時由于國內條件限制未能和51Cr釋放法作對比分析，僅通過對整個檢測流程驗證的基礎上來建立。