γδT 細(xì)胞是一群橋接固有免疫和適應(yīng)性免疫的獨(dú)特T 淋巴細(xì)胞亞群，約占外周淋巴細(xì)胞的0.5%~5%，在機(jī)體抗感染和抗腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)，γδT細(xì)胞在難治性前列腺癌、腎癌、非小細(xì)胞肺癌、多發(fā)性骨髓瘤、轉(zhuǎn)移性黑色素瘤、白血病和淋巴瘤的臨床治療中總客觀應(yīng)答率達(dá)40%，其中難治性前列腺癌和腎癌的客觀應(yīng)答率優(yōu)于二線化療藥。雖然取得了很好的臨床效應(yīng)，但缺乏一種準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)的方法評(píng)估其殺傷效應(yīng)，該方法的建立對(duì)推進(jìn)免疫細(xì)胞臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量體系的建設(shè)具有重要意義。免疫細(xì)胞細(xì)胞毒活性經(jīng)典的檢測(cè)方法是51Cr釋放法，由于放射性元素污染，極大地限制了該方法的應(yīng)用。其它檢測(cè)方法如MTT法、乳酸脫氫酶(LDH)釋放法，存在靈敏度不高、操作繁瑣的缺點(diǎn)。最近研究發(fā)現(xiàn)，用鈣黃綠素-AM(Calcein-AM)染色效應(yīng)細(xì)胞，檢測(cè)前用碘化丙啶(propidium iodide，PI)對(duì)死亡細(xì)胞染色，最后用流式細(xì)胞儀(flow cytometry，F(xiàn)CM)檢測(cè)，具有與51Cr 釋放法相當(dāng)?shù)臏?zhǔn)確性。然而經(jīng)典方法無(wú)法區(qū)分死亡細(xì)胞的來(lái)源：即來(lái)源于免疫細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷還是自然死亡。因此我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)，建立并優(yōu)化了Calcein-AM/PI 雙標(biāo)法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)γδT細(xì)胞殺傷性的方法，解決了上述方法的不足。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

Calcein-AM 購(gòu)自Invitrogen，PI、HMBPP 購(gòu)自Sigma，RPMI 1640、胎牛血清(FBS)購(gòu)自Gibco，重組人IL-2(rhIL-2)購(gòu)自北京雙鷺，硫酸慶大霉素購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)，人淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)�洋�？笴D3-FITC、抗CD3- PerCP、抗CD4-PE、抗CD8-PE、抗TCRVγ9-PE 熒光抗體和Trucount管購(gòu)自BD。流式細(xì)胞儀FACSCanto II和Z2全自動(dòng)細(xì)胞分析計(jì)數(shù)儀分別購(gòu)自BD和Beckman。

1.2 標(biāo)本來(lái)源和γδT細(xì)胞培養(yǎng)

采集健康成年志愿者外周靜脈血，肝素抗凝，生理鹽水等體積稀釋后，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs);充分洗滌后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/ml，重懸于含5% FBS、5%人自體血漿和80 IU/ml硫酸慶大霉素的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中。接種于T25培養(yǎng)瓶，每瓶5 ml，同時(shí)加入HMBPP和rhIL-2，終質(zhì)量濃度均為20 ng/ml，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2~3天進(jìn)行補(bǔ)液或傳代，補(bǔ)液使用含有300 IU/ml rhIL-2的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，補(bǔ)液后細(xì)胞數(shù)維持在(0.5~1)×106 /ml，培養(yǎng)至7~10 d收集細(xì)胞，經(jīng)上述條件處理可獲得γδT細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞株K562 和A549 均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，用含有10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 Calcein-AM 標(biāo)記靶細(xì)胞Calcein-AM 以二甲基亞砜(DMSO)配制成儲(chǔ)存液(2 mmol/L)，分裝后-20 ℃ 保存。不同的腫瘤細(xì)胞有不同的染色條件，為了確定染色條件，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562、A549細(xì)胞，PBS洗滌2 次后調(diào)整細(xì)胞數(shù)為4×106/ml，添加于24孔板，每孔1 ml;將倍比稀釋的Calcein-AM加入上述細(xì)胞孔，終濃度分別為1、0.5、0.25、0.125、0.0 625、0.0 313、0.0 156、0.0 078 μmol/L，每一梯度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，然后于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min;孵育結(jié)束后，用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌2次，制備成1×105/ml細(xì)胞懸液，分別于0、4和24 h上機(jī)檢測(cè)MFI值。固定Calcein-AM濃度為0.5 μmol/L，調(diào)整細(xì)胞數(shù)分別為5×104/ml、1×105/ml、2×105/ml、4×105/ml、8×105/ml、1.6×106/ml、3.2×106/ml、6.4×106 /ml、1.28×107/ml，然后按照上述步驟進(jìn)行染色、洗滌和檢測(cè)MFI值。

1.4 細(xì)胞收集、PI 染色和流式檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作程序?qū)�Calcein-AM 標(biāo)記好的腫瘤細(xì)胞與γδT細(xì)胞按1∶10的比例制備成細(xì)胞數(shù)分別為1×105/ml、1×106/ml的混合細(xì)胞懸液，加入24孔培養(yǎng)板，1 ml/孔;同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，含1×105 /ml Calcein-AM 標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞，1 ml/孔。每組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)共孵育30 min。孵育結(jié)束后，取出細(xì)胞充分重懸后移入2 ml EP 管內(nèi)，然后用PBS 洗滌1 次，洗滌液移入對(duì)應(yīng)EP管內(nèi)，并用PBS調(diào)整每管的體積為2 ml。上述細(xì)胞懸液充分重懸后取450 μl于新的EP管內(nèi)，加入終質(zhì)量濃度為5 μg/ml的PI 染色，避光、冰浴20 min 后移入經(jīng)抗CD3-FITC、抗CD4-PE 同型對(duì)照抗體染色的體積為500 μl 的絕對(duì)計(jì)數(shù)管內(nèi)。上機(jī)檢測(cè)，按固定體積100 μl 收集計(jì)數(shù)。

1.5 γδT細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒效應(yīng)檢測(cè)Calcein-AM標(biāo)記好的腫瘤細(xì)胞(K562、A549)，2×105/ml，0.5 ml/孔加入24孔培養(yǎng)板，然后按照不同的效靶比(5∶1、10∶1 和20∶1)將γδT細(xì)胞加入上述培養(yǎng)板孔內(nèi)，最后用完全RPMI 1640培養(yǎng)基補(bǔ)充至1 ml/孔;同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，含1×105 /ml Calcein-AM 標(biāo)記的K562和A549 細(xì)胞，體積為1 ml，每組均設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃，5% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)共孵育24 h。按照1.4 操作程序，進(jìn)行細(xì)胞收集、PI 染色和流式檢測(cè)，最后用FlowJo 軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，γδT細(xì)胞殺傷率計(jì)算公式為：1-實(shí)驗(yàn)組Calcein-AM 單陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/對(duì)照組Calcein-AM單陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，采用t 檢驗(yàn)、單因素方差分析或簡(jiǎn)單線性回歸分析完成相關(guān)數(shù)據(jù)分析。P<0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Calcein-AM 工作濃度與靶細(xì)胞密度相關(guān)性分析流式檢測(cè)不同Calcein-AM 濃度對(duì)腫瘤細(xì)胞(K562、A549)染色平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescenceintensity，MFI)的影響。結(jié)果顯示，A549和K562在不同濃度Calcein-AM標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞均能顯示一個(gè)單一的峰值，MFI隨Calcein-AM 濃度升高而增強(qiáng)。進(jìn)一步簡(jiǎn)單線性回歸分析顯示，A549和K562的MFI 與Calcein-AM 濃度呈線性正相關(guān)(R2 =0.971 0，P<0.000 1)。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探討了Calcein-AM標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞密度的相關(guān)性。Calcein-AM的工作濃度為0.5 μmol/L，以K562為例，設(shè)定K562細(xì)胞數(shù)分別為5×104/ml、1×105/ml、2×105/ml、4×105/ml、8×105/ml、1.6×106/ml、3.2×106/ml、6.4×106/ml、1.28×107/ml。結(jié)果顯示，Calcein-AM 對(duì)不同細(xì)胞數(shù)K562 也均顯示一個(gè)單一的峰值，不同的是MFI 隨K562密度的增加而降低。簡(jiǎn)單線性回歸分析顯示，MFI與K562密度呈線性負(fù)相關(guān)(R2= 0.476 7，P<0.000 1)。

2.2 靶細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度時(shí)間動(dòng)力學(xué)變化特征性分析為了研究Calcein-AM標(biāo)記的K562 MFI 是否隨時(shí)間變化，將染色的K562分別0、4和24 h上流式檢測(cè)。結(jié)果顯示，隨著染色時(shí)間延長(zhǎng)MFI逐漸降低，3組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。此外，我們還檢測(cè)了Calcein-AM染色對(duì)細(xì)胞活率是否產(chǎn)生影響，利用PI檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞死亡比例。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性分析在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們應(yīng)用抗CD3-PerCP 和抗CD4-PE的同型對(duì)照抗體對(duì)標(biāo)準(zhǔn)磁珠進(jìn)行染色，絕對(duì)計(jì)數(shù)管原理是計(jì)數(shù)管的Beads數(shù)量是已知，當(dāng)固定上樣體積時(shí)，即可知Beads的濃度。流式可以記錄顆粒數(shù)，上樣后機(jī)器根據(jù)顆粒數(shù)量算上體積，從而計(jì)算出樣本的濃度，進(jìn)一步對(duì)流式收集細(xì)胞過(guò)程的穩(wěn)定性和計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)磁珠和Calcein-AM 標(biāo)記的活細(xì)胞群分群明顯，經(jīng)BD絕對(duì)計(jì)數(shù)管計(jì)數(shù)和給定值之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(47 200±208 vs 47 150，P=0.324>0.05)。同時(shí)，經(jīng)孵育30 min的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組Calcein-AM 標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(98 642±876 vs 98 692±769，P=0.698 7>0.05)。

2.4 γδT 細(xì)胞對(duì)Calcein-AM標(biāo)記靶細(xì)胞殺傷功能檢測(cè)利用上述優(yōu)化條件，我們?cè)u(píng)估了不同效靶比下，γδT細(xì)胞與K562和A549細(xì)胞共孵育24 h的殺傷活性。結(jié)果顯示，效靶比分別為5∶1、10∶1、20∶1條件下，K562 殺傷率分別為0.63±0.02、0.84±0.02、0.91±0.02，與5∶1組相比，10∶1、20∶1組殺傷率明顯提高(P<0.01)，但是10∶1和20∶1組之間殺傷率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4);A549殺傷率分別為0.38±0.02、0.5± 0.02、0.65±0.02，與5∶1組相比，10∶1、20∶1組殺傷率明顯提高(P<0.01)，但是10∶1和20∶1組之間殺傷率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因?yàn)椴煌�的腫瘤細(xì)胞，γδT的殺傷有不同的結(jié)果，從上述結(jié)果來(lái)看，對(duì)血液瘤的殺傷率就比實(shí)體瘤的要高。

3 討論

近年來(lái)，以免疫細(xì)胞為基礎(chǔ)的腫瘤免疫治療在臨床應(yīng)用中取得了巨大進(jìn)展。如何通過(guò)一種簡(jiǎn)單的方式、準(zhǔn)確評(píng)價(jià)其細(xì)胞毒活性，則對(duì)免疫細(xì)胞臨床應(yīng)用質(zhì)量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化體系的建設(shè)相當(dāng)重要。測(cè)定免疫細(xì)胞細(xì)胞毒活性最經(jīng)典的方法是51Cr 釋放法。該方法準(zhǔn)確且重復(fù)性好，但存在很多不足，如51Cr本身的放射性污染、自發(fā)釋放率高以及檢測(cè)需要大量的免疫細(xì)胞等內(nèi)在缺陷，使其應(yīng)用受到了極大限制。目前產(chǎn)生了很多51Cr釋放法替代性方法，其中基于流式細(xì)胞術(shù)的Calcein-AM/PI雙染法取得了很好的效果。Jang 等報(bào)道采用Calcein-AM對(duì)NK細(xì)胞染色檢測(cè)其細(xì)胞毒活性，流式檢測(cè)前用PI染色，結(jié)果與51Cr釋放法檢測(cè)近似。該方法直接通過(guò)死亡細(xì)胞占總靶細(xì)胞的百分比來(lái)計(jì)算殺傷效應(yīng)，無(wú)法區(qū)分死亡細(xì)胞是自然死亡還是NK細(xì)胞介導(dǎo)的殺傷性死亡。因此，該方法尚存在一定的局限性。

本研究成功建立并優(yōu)化了基于流式細(xì)胞術(shù)的Calcein-AM/PI雙染法檢測(cè)γδT細(xì)胞殺傷效應(yīng)。選擇K562和A549作為靶細(xì)胞，首先確定了Calcein-AM工作濃度和靶細(xì)胞密度，在0.1~0.5 μmol/L的濃度范圍內(nèi)有很好的線性關(guān)系，濃度為0.5 μmol/L時(shí)，靶細(xì)胞有較寬的密度范圍選擇。因此，本實(shí)驗(yàn)為應(yīng)用Calcein-AM進(jìn)行不同密度靶細(xì)胞染色提供了參考。接著研究時(shí)間對(duì)靶細(xì)胞MFI變化以及Calcein-AM對(duì)靶細(xì)胞存活的影響，發(fā)現(xiàn)MFI隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，而染料本身對(duì)細(xì)胞存活無(wú)明顯影響，這與以前的報(bào)道相一致[16, 19]。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)優(yōu)化染料濃度和靶細(xì)胞密度，染色24 h后還能很好的與未染細(xì)胞區(qū)分，較Cholujova等染色后需3~4 h內(nèi)檢測(cè)，時(shí)間有明顯延長(zhǎng)[19]。因此通過(guò)本優(yōu)化方案，可以使效靶細(xì)胞共孵育時(shí)間延長(zhǎng)到24 h，從而更加有效的反應(yīng)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。另外，本研究通過(guò)BD絕對(duì)計(jì)數(shù)管驗(yàn)證了流式操作過(guò)程的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，絕對(duì)計(jì)數(shù)管原理是：根據(jù)計(jì)數(shù)管已知的Beads數(shù)量，當(dāng)固定上樣體積時(shí)，即可知Beads的濃度。流式可以記錄細(xì)胞的顆粒數(shù)，上樣后機(jī)器根據(jù)顆粒數(shù)量和體積，從而計(jì)算出樣本的濃度，進(jìn)一步對(duì)流式收集細(xì)胞過(guò)程的穩(wěn)定性和計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性進(jìn)行驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)選擇染色后30 min檢測(cè)對(duì)腫瘤細(xì)胞計(jì)數(shù)，是因?yàn)?0 min細(xì)胞能夠很好的貼壁，同時(shí)對(duì)靶細(xì)胞的殺傷效應(yīng)還未顯示。因此能夠很好的模擬效靶細(xì)胞共孵育更長(zhǎng)時(shí)間的貼壁狀態(tài)，從而更好的驗(yàn)證收集、PI染色和上流式操作的程序。

最后在上述優(yōu)化的條件下，檢測(cè)了誘導(dǎo)培養(yǎng)第10 天γδT 細(xì)胞對(duì)K562 和A549 細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。γδT細(xì)胞是PBMCs經(jīng)HMBPP和rhIL-2聯(lián)合誘導(dǎo)培養(yǎng)的一群以Vγ9Vδ2 T細(xì)胞為主的細(xì)胞群，增殖力高達(dá)1 000倍(數(shù)據(jù)未顯示)。流式檢測(cè)后，通過(guò)先計(jì)算靶細(xì)胞存活率，然后用“1-存活率”的方法間接計(jì)算其殺傷率，發(fā)現(xiàn)共孵育24 h，不同的腫瘤細(xì)胞有不同的殺傷效率，對(duì)于K562細(xì)胞，當(dāng)效靶比為5∶1時(shí)即可檢測(cè)到明顯的殺傷效應(yīng)，10∶1時(shí)，殺傷率就高達(dá)90%以上，而對(duì)于A549細(xì)胞，當(dāng)效靶比為5∶1時(shí)殺傷率為38%，10∶1，20∶1是額殺傷分別達(dá)50%和60%以上(圖4、5)。因此我們建立一種高效擴(kuò)增、并具有高細(xì)胞毒活性的γδT 細(xì)胞培養(yǎng)方案;通過(guò)本方法能夠很好的對(duì)其細(xì)胞毒活性進(jìn)行檢測(cè)。由于使用對(duì)照的方式排除了反應(yīng)過(guò)程中自然死亡細(xì)胞，因此更能真實(shí)反應(yīng)γδT細(xì)胞的細(xì)胞毒活性。同時(shí)由于國(guó)內(nèi)條件限制未能和51Cr釋放法作對(duì)比分析，僅通過(guò)對(duì)整個(gè)檢測(cè)流程驗(yàn)證的基礎(chǔ)上來(lái)建立。