前言

目前，樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)被認(rèn)為是體內(nèi)功能最強(qiáng)、唯一能激活初始T 細(xì)胞的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigenpresenting cells, APCs)，或啟動獲得性免疫反應(yīng)、或誘導(dǎo)免疫耐受，是聯(lián)系先天免疫與獲得性免疫的樞紐。DCs 通過模式識別受體參與抗原物質(zhì)的識別、內(nèi)化、處理和加工等。皮膚作為人體最大的器官，是最重要的天然免疫屏障，也是聯(lián)系體內(nèi)外環(huán)境的樞紐。皮膚樹突狀細(xì)胞包括表皮朗格漢斯細(xì)胞(Langerhanscells，LCs)和真皮樹突狀細(xì)胞(Dermal dendritic cells，DDCs.)。LC 可特征性地表達(dá)CD1a 及獨特細(xì)胞器-Birbeck 顆粒(BG);DDCs 進(jìn)一步分為CD1ahigh/CD4+/CD14-/CD16-/CD2O6high/CD207/CD209+ 細(xì)胞和CD1a1ow/CD4+/CD14+/CD16-/CD206low/CD207-/CD209+ 細(xì)胞。在正常非炎癥情況下，定居皮膚的LC 前體細(xì)胞主要存在于真皮，且在轉(zhuǎn)化生長因子B(TGF B)和CCL20 共同作用下，LC 前體可通過真表皮屏障。DCs 是皮膚免疫系統(tǒng)的重要組成部分，或誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，或誘導(dǎo)免疫耐受。本研究采用CD1a、CD209 和MHCII 進(jìn)行免疫組化染色，著重觀察正常新生兒指皮組織DCs的形態(tài)、數(shù)量以及分布狀況。

1 材料和方法

1.1 材料

5 例尸檢新生兒雙手無名指組織(小塊指尖組織，生后1天死亡，死后24 小時送檢)取自陜西省高新醫(yī)院送檢的尸檢病例。所取組織發(fā)育良好，無炎癥、壞死和腫瘤。OCT 冷凍包埋劑包埋指皮組織進(jìn)行縱(垂直)切片觀察。小鼠抗人CD209 單克隆抗體，購自R&D 公司產(chǎn)品(產(chǎn)品號120509，工作濃度為1:200)，小鼠抗人CD1a 單克隆抗體購自DAKO 公司(產(chǎn)品號為F7141 ，工作濃度為1:100)，小鼠抗人MHC 單克隆抗體購自Antibody Diagnostica 公司(產(chǎn)品號為M--0305 ，工作濃度為1:100)，二抗試劑盒(產(chǎn)品號SP9002)和DAB 顯色試劑盒(產(chǎn)品號SP9002)均購自北京中衫金橋公司。值得指出的是，本研究已通過西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核，所取新生兒手指(無名指指尖)樣本均符合倫理原則。

1.2 制片及免疫組化染色

每例新生兒左手無名指組織做冰凍切片(厚度為3 微米)，行免疫組化染色，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染;空白對照用PBS 代替單抗,其他染色步驟相同;每例新生兒右手無名指組織，常規(guī)石蠟切片，HE 染色,光鏡觀察。先在低倍鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色陽性部位，再轉(zhuǎn)到高倍鏡下讀取陽性細(xì)胞數(shù)量，每一標(biāo)本取10 個高倍視野進(jìn)行陽性細(xì)胞計數(shù)，比較陽性細(xì)胞的表達(dá)情況。

1.3 結(jié)果判定

以胞膜及胞漿為棕黃色顆粒的細(xì)胞作為陽性細(xì)胞，以棕黃色顆粒的軸突作為陽性軸突。每張切片隨機(jī)取10 個高倍鏡視野(×400)，每個視野陽性細(xì)胞計數(shù)為每項相加后的總分值，每張切片的陽性細(xì)胞計數(shù)為10 個視野分值的平均數(shù)，計數(shù)染色陽性細(xì)胞和細(xì)胞總數(shù)，計算細(xì)胞陽性率：細(xì)胞陽性率= 陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%，結(jié)果以x±s 表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以x±s 表示，多組間率的比較采用卡方檢驗，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病理學(xué)觀察

光鏡下，陽性細(xì)胞呈棕褐色，大小不等、形態(tài)多樣，有數(shù)量不等的突起，呈散在或灶帶狀分布。CD1a 標(biāo)記的陽性細(xì)胞胞膜有棕黃色物質(zhì)沉著，細(xì)胞呈長梭形，有兩個長短粗細(xì)不等突起，不同細(xì)胞間突起可相互連接，形態(tài)不規(guī)則，胞體較大，呈圓形或卵圓形，樹突狀突起依稀可見。該陽性細(xì)胞主要分布于表皮乳頭周圍，血管外膜以及真皮疏松結(jié)締組織。CD209 標(biāo)記的陽性細(xì)胞多為位于真皮層內(nèi)，血管神經(jīng)分叉處，血管外膜，環(huán)層小體被囊結(jié)締組織中，細(xì)胞形態(tài)各異，圓形或長梭形。MHCII 標(biāo)記的陽性細(xì)胞多位于真皮乳頭周圍、血管外膜處，細(xì)胞呈圓形或長梭形，伸出長短粗細(xì)不等的突起，陰性對照未見陽性細(xì)胞，石蠟HE 切片未見異常改變。

2.2 統(tǒng)計學(xué)結(jié)果

指皮組織中CD1a 標(biāo)記的DCs 陽性率(23±11.9)%，CD209 標(biāo)記的DCs 陽性率為(30±7.7)%，MHCII 標(biāo)記的DCs 陽性率為(8±1.9)%，卡方檢驗顯示三組陽性率不同(X2=299.575)，CD1a 組和CD209 組標(biāo)記的陽性細(xì)胞率高于MHCII 標(biāo)記組(P<0.05)。

3 討論

DCs 是Steinman和Cohn(1973 年)從小鼠脾臟組織中分離出的一類形態(tài)特殊的細(xì)胞，因其具有神經(jīng)細(xì)胞樣的樹突而命名。目前，樹突狀細(xì)胞被認(rèn)為是體內(nèi)功能最強(qiáng)的、唯一能激活初始T 細(xì)胞、啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答的專職抗原提呈細(xì)胞(Antigenpresenting cells, APCs)，是聯(lián)系先天免疫與獲得性免疫的樞紐。皮膚LC(Langerhans cell, LC)表達(dá)免疫標(biāo)記分子Fc R、CR、MHCⅡ和CD207/ Langerin，真皮DCs 缺乏特異標(biāo)記分子。CD1a 是一種提呈脂類抗原的抗原呈遞分子，能將脂質(zhì)抗原遞給T 細(xì)胞群和T 細(xì)胞群，目前被公認(rèn)為未成熟DCs(immatureDCs, imDCs)主要特征性標(biāo)志。表達(dá)CD1a 的樹突狀細(xì)胞主要為LC，但Nest le 等報道DDC 中約12 %～40 %表達(dá)CD1a。研究發(fā)現(xiàn)，CD1a 可能介導(dǎo)腫瘤源性脂質(zhì)和糖脂抗原向腫瘤特異性的T 細(xì)胞遞呈，從而促進(jìn)這些溶細(xì)胞性細(xì)胞的抗瘤免疫反應(yīng)的發(fā)生，它在各個系統(tǒng)的腫瘤中均有表達(dá)，但表達(dá)機(jī)制不完全相同[1。真皮CD1c+DCs 和LCs 都表達(dá)CD1a，人CD1a+DDCs 在表型和功能上都存在異質(zhì)性。與LC 一樣，人CD1a+DDCs 可分泌IL-1，并可激活初始CD8+T 細(xì)胞。但與LC 不同的是，人CD1a+DCs 可表達(dá)CD11b，分泌IL-8。DC-SIGN ，即CD209，亦稱HIV-1 gp120 結(jié)合C 型凝集素。皮膚組織中，表皮層內(nèi)的CD1a+LCs 并不表達(dá)CD209，而真皮層內(nèi)的DCs 表達(dá)此標(biāo)記。

研究表明，CD209 具有正負(fù)雙向免疫調(diào)節(jié)功能: 一方面介導(dǎo)外源性抗原提呈、DCs 遷移及T 細(xì)胞活化，引發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答，在抗感染免疫和抗腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮關(guān)鍵作用;另一方面可誘導(dǎo)宿主對多種病原體產(chǎn)生免疫耐并參與腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。MHC II 是最能反映DCs免疫功能的主要分子之一，表達(dá)于成熟DCs，是DCs 識別、攝取抗原以及其他免疫細(xì)胞信號傳遞的必要條件。MHCII 分子主要參與識別、提呈外源性抗原。

DCs 群來源多樣，分布廣泛，功能各異，具有高度的異質(zhì)性。炎癥和穩(wěn)態(tài)下，皮膚DCs 的分類不同，功能各異。不同亞群的更新速度亦不同。皮膚組織作為人體抵御外界感染的第一道防線，具有天然的免疫屏障作用。明確DCs 在指皮組織的形態(tài)，分布及數(shù)量是很有必要的。目前，皮膚DCs 群的研究對象多來自動物模型。而對于人皮膚DCs 群的體內(nèi)形態(tài)功能研究仍未深入，有關(guān)穩(wěn)態(tài)下人皮膚DCs 的分化和功能更知之甚少。本研究采用CD1a、CD209 和MHCII 標(biāo)記新生兒指尖皮膚及皮下組織DCs，清晰觀察到表皮乳頭周圍、血管外膜、血管神經(jīng)分叉處周圍、真皮疏松結(jié)締組織中以及環(huán)層小體被囊結(jié)締組織中，陽性細(xì)胞呈棕褐色，大小不等、形態(tài)多樣，具有數(shù)量、長短粗細(xì)不等的突起，呈散在或灶帶狀分布。且CD1a 和CD209 標(biāo)記的不成熟DCs 數(shù)量高于MHCII 標(biāo)記的成熟DCs。本研究發(fā)現(xiàn)，正常條件下，新生兒指尖皮膚及皮下組織中存在一群分布不同，形態(tài)、功能各異的DCs 群，且處在不同的生長發(fā)育分化階段，并以表達(dá)不成熟DCs 為主，這豐富了皮膚免疫系統(tǒng)的構(gòu)成，也為全面認(rèn)識皮膚DCs 的異質(zhì)性和復(fù)雜的生物學(xué)行為提供依據(jù)。