白血病是嚴(yán)重危害人類生命健康的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其生物學(xué)特征表現(xiàn)為細(xì)胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡過程發(fā)生障礙，因而導(dǎo)致分化異常細(xì)胞大量增殖。抑制白血病細(xì)胞增殖、促進(jìn)白血病細(xì)胞分化和凋亡，是治療白血病的基本途徑。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(deathdomain-associatedprotein，Daxx)是一種受體胞漿死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，在凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、病毒感染等方面發(fā)揮重要作用。Daxx可以通過結(jié)合DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、E2A、Ets-1、Pax3和Pax5等參與基因表達(dá)的調(diào)控，Pax和Ets轉(zhuǎn)錄因子均和多種類型細(xì)胞的分化活動(dòng)有關(guān)，Daxx可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控細(xì)胞分化。Daxx通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2A，抑制E2A的功能，進(jìn)而抑制肌細(xì)胞生成，參與肌細(xì)胞分化過程。Daxx基因在白血病細(xì)胞中廣泛表達(dá)，人急性白血病(acuteleukemia，AL)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，CLL)及其它惡性血液病細(xì)胞內(nèi)均可見Daxx表達(dá)。而Daxx在這些血液病中的具體作用機(jī)制，目前研究不多。Daxx在白血病細(xì)胞中的廣泛表達(dá)，是否與白血病細(xì)胞的分化有關(guān)，目前未見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以K562細(xì)胞為研究對(duì)象，初步研究Daxx與K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化是否存在相關(guān)性。

材料和方法

1主要試劑

K562細(xì)胞株由嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院提供;DMEM培養(yǎng)液和新生牛血清購于HyClone;Daxx購于Sigma;G418購自Amresco;兔抗CD41和CD61購自BD;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG和硝基四氮唑藍(lán)(nitrobluetetrazolium，NBT)購自杭州昊鑫生物科技有限公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司;蛋白marker購自Thermo;Lipofectamine2000購自Invitrogen。

2主要方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)K562細(xì)胞株由本室保存，常規(guī)傳代培養(yǎng)。采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2穩(wěn)定過表達(dá)Daxx的K562細(xì)胞系(Daxx-K562)的建立取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞接種于6孔板中，每孔用50μL無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋1μgGFPDaxx質(zhì)粒和GFP-空載質(zhì)粒(GFP-Daxx質(zhì)粒和GFP-空載質(zhì)粒由嘉興學(xué)院潘巍巍博士提供);采用50μL無血清DMEN培養(yǎng)基稀釋1μLLipofectamine2000，混勻靜置5min;將質(zhì)粒與Lipofectamine2000混合后室溫靜置20min，分別接種于培養(yǎng)板。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中48h，熒光顯微鏡觀察表達(dá)情況。換液，加G418后繼續(xù)培養(yǎng)。G418篩選2周后，有限稀釋法獲得單個(gè)熒光表達(dá)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，建立GFPDaxx-K562細(xì)胞。

2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)TRIzol法提取各組總RNA，按試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄后，選用10μL體系進(jìn)行熒光定量PCR。反應(yīng)條件:95℃5min;95℃30s，55℃30s，72℃40s，40個(gè)循環(huán)。

2.4CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力在96孔板中接種GFP-Daxx過表達(dá)組細(xì)胞和對(duì)照組細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24h后，每孔加入10μLCCK-8，37℃孵育2h，酶標(biāo)儀測(cè)定450nm波長(zhǎng)附近的吸光度。每組4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。

2.5流式細(xì)胞術(shù)收集佛波酯(phorbol12-myristate13.acetate，PMA)處理72h后的GFP-Daxx過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞，連同PMA未處理組細(xì)胞，PBS洗2遍，收集10000個(gè)細(xì)胞，PBS稀釋到50μL重懸細(xì)胞后加入1μLPE標(biāo)記CD61抗體或CD41抗體，室溫避光靜置30min，預(yù)冷PBS洗滌2次后上機(jī)檢測(cè)。

2.6NBT還原實(shí)驗(yàn)取經(jīng)PMA作用72h后的GFPDaxx過表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞，與2g/L的NBT溶液混合，37℃孵育30min后離心涂片，Giemsa染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胞質(zhì)內(nèi)含藍(lán)灰色顆粒的陽性細(xì)胞。

2.7Westernblot實(shí)驗(yàn)收集細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次后加入RIPA細(xì)胞裂解液，冰上放置30min，4℃13000×g離心30min，收集上清，BCA法蛋白定量。取30μg總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。后加入相應(yīng)I抗4℃孵育過夜，加II抗室溫孵育2h。最后用ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。

3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1過表達(dá)Daxx的K562細(xì)胞系的建立

熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，GFP-Daxx在細(xì)胞內(nèi)聚集，并表達(dá)于細(xì)胞核。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)過表達(dá)細(xì)胞系Daxx的mRNA水平顯著高于對(duì)照組，Westernblot結(jié)果顯示，過表達(dá)Daxx的K562細(xì)胞中，Daxx蛋白表達(dá)明顯升高。

2過表達(dá)Daxx對(duì)K562細(xì)胞活力的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)Daxx后K562細(xì)胞的活力明顯低于對(duì)照(K562細(xì)胞)組(P<0.01)。

3PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化

流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示，PMA處理K562細(xì)胞后CD41和CD61的表達(dá)升高，見圖4。Westernblot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的過程中，p-ERK的蛋白水平升高，Daxx的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。

4過表達(dá)Daxx對(duì)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的影響

過表達(dá)Daxx后，PMA誘導(dǎo)GFD-Daxx-K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD41和CD61的表達(dá)均明顯低于對(duì)照(K562細(xì)胞)組(P<0.01)。NBT還原實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Daxx過表達(dá)后，分化細(xì)胞數(shù)量與對(duì)照組相比明顯降低(P<0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，過表達(dá)Daxx后，p-ERK的蛋白水平相對(duì)于對(duì)照組下降。

討論

Daxx最初發(fā)現(xiàn)它是一種受體胞漿死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，之后證實(shí)它是一種定位于細(xì)胞核亞核結(jié)構(gòu)早幼粒細(xì)胞白血病蛋白(promyelocyticleukemiaprotein，PML)癌基因結(jié)構(gòu)域(PMLocogeneicdomains，PODs)的核蛋白。Daxx廣泛分布于哺乳動(dòng)物和人正常組織細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞中，在凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、病毒感染等方面發(fā)揮重要作用。作為一種重要的信號(hào)分子，Daxx可以在細(xì)胞質(zhì)介導(dǎo)腫瘤壞死因子受體(tumournecrosisfactorreceptor，TNFR)超家族成員促凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞核也可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中行使轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活雙重功能，通過轉(zhuǎn)位、化學(xué)修飾、染色體調(diào)節(jié)、直接與轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相互作用等多種方式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Daxx廣泛分布于哺乳動(dòng)物和人的正常細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞，在血液病中廣泛表達(dá)，作為Fas受體胞漿死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，Daxx可以經(jīng)Fas-Daxx-ASK1-JNK通路發(fā)揮促凋亡的作用;Daxx也可以發(fā)揮抗凋亡作用，在Daxx基因缺失的小鼠中，其胚胎干細(xì)胞發(fā)生凋亡，不能正常發(fā)育。Daxx可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白或相關(guān)因子，如E2A、Ets-1、Pax3和Pax5等，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控。

有研究表明，Daxx參與細(xì)胞分化，Daxx通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2A，抑制E2A的功能，從而抑制關(guān)鍵的肌原性基因表達(dá)和減少肌小管的形成，抑制肌細(xì)胞生成，參與肌細(xì)胞分化過程;Daxx可以促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)以及其化療耐藥性，Daxx可以通過抑制自噬促進(jìn)前列腺癌的發(fā)生。關(guān)于Daxx在血液腫瘤中的作用，相關(guān)研究較少。

人白血病K562細(xì)胞株是慢性粒細(xì)胞白血病的一個(gè)典型的細(xì)胞系，其在體外被相關(guān)藥物誘導(dǎo)后具有向巨核系、單核系或紅系等多個(gè)方向分化潛能。K562細(xì)胞可以作為巨核細(xì)胞系分化模型，PMA是蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)的激動(dòng)劑，K562細(xì)胞能被PMA誘導(dǎo)分化成為具有巨核系特征的細(xì)胞。PKC是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和細(xì)胞因子分泌等過程中發(fā)揮著重要作用，ERK是經(jīng)典MAP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，介導(dǎo)多種細(xì)胞生物學(xué)過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、存活、分化和炎癥反應(yīng)等。PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化過程中，ERK信號(hào)通路通常被激活。目前研究表明，影響PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的因素很多，KRAB-ZFPs是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，ZNF300是其典型成員，在PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào)，參與調(diào)控K562細(xì)胞巨核細(xì)胞分化。電離輻射可以促進(jìn)PMA誘導(dǎo)的K562細(xì)胞巨核細(xì)胞分化，MAPK信號(hào)通路中ERK和P38MAPK參與此過程調(diào)控。過表達(dá)7號(hào)染色體開放閱讀框41(C7ORF41)可以促進(jìn)佛波酯誘導(dǎo)的K562細(xì)胞巨核細(xì)胞分化，p-ERK和JNK的蛋白水平升高。在PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞巨核細(xì)胞分化過程中，線粒體功能發(fā)生明顯改變，ROS水平明顯升高，線粒體膜電位下降，呼吸鏈復(fù)合體IV活性降低。而關(guān)于Daxx與K562細(xì)胞巨核細(xì)胞分化的關(guān)聯(lián)研究目前尚未見報(bào)道。

為研究Daxx在K562細(xì)胞中的作用，建立穩(wěn)定表達(dá)Daxx的K562細(xì)胞系，CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Daxx過表達(dá)后，細(xì)胞活力顯著降低。通過PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，發(fā)現(xiàn)在巨核細(xì)胞分化過程中p-ERK表達(dá)升高，Daxx表達(dá)下降，表明Daxx在K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化過程中起抑制作用。PMA誘導(dǎo)Daxx-K562細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)分化細(xì)胞數(shù)目降低，細(xì)胞巨核細(xì)胞分化指標(biāo)CD41和CD61的表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步表明Daxx參與抑制K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化。Westernblot結(jié)果顯示，Daxx過表達(dá)后，PMA誘導(dǎo)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化，p-ERK的蛋白水平降低，表明Daxx可能通過下調(diào)p-ERK來實(shí)現(xiàn)對(duì)K562細(xì)胞向巨核細(xì)胞分化的抑制，但有關(guān)深入的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步的研究。