白血病是嚴重危害人類生命健康的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，其生物學特征表現(xiàn)為細胞增殖失控、分化成熟受阻、正常凋亡過程發(fā)生障礙，因而導致分化異常細胞大量增殖。抑制白血病細胞增殖、促進白血病細胞分化和凋亡，是治療白血病的基本途徑。死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白(deathdomain-associatedprotein，Daxx)是一種受體胞漿死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，在凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、病毒感染等方面發(fā)揮重要作用。Daxx可以通過結(jié)合DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子、E2A、Ets-1、Pax3和Pax5等參與基因表達的調(diào)控，Pax和Ets轉(zhuǎn)錄因子均和多種類型細胞的分化活動有關(guān)，Daxx可能通過影響轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)控細胞分化。Daxx通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2A，抑制E2A的功能，進而抑制肌細胞生成，參與肌細胞分化過程。Daxx基因在白血病細胞中廣泛表達，人急性白血病(acuteleukemia，AL)、慢性淋巴細胞白血病(chroniclymphocyticleukemia，CLL)及其它惡性血液病細胞內(nèi)均可見Daxx表達。而Daxx在這些血液病中的具體作用機制，目前研究不多。Daxx在白血病細胞中的廣泛表達，是否與白血病細胞的分化有關(guān)，目前未見相關(guān)報道。本實驗以K562細胞為研究對象，初步研究Daxx與K562細胞向巨核細胞分化是否存在相關(guān)性。

材料和方法

1主要試劑

K562細胞株由嘉興學院醫(yī)學院提供;DMEM培養(yǎng)液和新生牛血清購于HyClone;Daxx購于Sigma;G418購自Amresco;兔抗CD41和CD61購自BD;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG和硝基四氮唑藍(nitrobluetetrazolium，NBT)購自杭州昊鑫生物科技有限公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購自東洋紡生物科技有限公司;蛋白marker購自Thermo;Lipofectamine2000購自Invitrogen。

2主要方法

2.1細胞培養(yǎng)K562細胞株由本室保存，常規(guī)傳代培養(yǎng)。采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2穩(wěn)定過表達Daxx的K562細胞系(Daxx-K562)的建立取對數(shù)生長期K562細胞接種于6孔板中，每孔用50μL無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋1μgGFPDaxx質(zhì)粒和GFP-空載質(zhì)粒(GFP-Daxx質(zhì)粒和GFP-空載質(zhì)粒由嘉興學院潘巍巍博士提供);采用50μL無血清DMEN培養(yǎng)基稀釋1μLLipofectamine2000，混勻靜置5min;將質(zhì)粒與Lipofectamine2000混合后室溫靜置20min，分別接種于培養(yǎng)板。置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中48h，熒光顯微鏡觀察表達情況。換液，加G418后繼續(xù)培養(yǎng)。G418篩選2周后，有限稀釋法獲得單個熒光表達細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，建立GFPDaxx-K562細胞。

2.3實時熒光定量PCR實驗TRIzol法提取各組總RNA，按試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄后，選用10μL體系進行熒光定量PCR。反應條件:95℃5min;95℃30s，55℃30s，72℃40s，40個循環(huán)。

2.4CCK-8法檢測細胞活力在96孔板中接種GFP-Daxx過表達組細胞和對照組細胞懸液，培養(yǎng)24h后，每孔加入10μLCCK-8，37℃孵育2h，酶標儀測定450nm波長附近的吸光度。每組4個復孔，重復3次。

2.5流式細胞術(shù)收集佛波酯(phorbol12-myristate13.acetate，PMA)處理72h后的GFP-Daxx過表達組和對照組細胞，連同PMA未處理組細胞，PBS洗2遍，收集10000個細胞，PBS稀釋到50μL重懸細胞后加入1μLPE標記CD61抗體或CD41抗體，室溫避光靜置30min，預冷PBS洗滌2次后上機檢測。

2.6NBT還原實驗取經(jīng)PMA作用72h后的GFPDaxx過表達組和對照組細胞，與2g/L的NBT溶液混合，37℃孵育30min后離心涂片，Giemsa染色，光學顯微鏡下觀察胞質(zhì)內(nèi)含藍灰色顆粒的陽性細胞。

2.7Westernblot實驗收集細胞，預冷PBS洗滌3次后加入RIPA細胞裂解液，冰上放置30min，4℃13000×g離心30min，收集上清，BCA法蛋白定量。取30μg總蛋白進行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h。后加入相應I抗4℃孵育過夜，加II抗室溫孵育2h。最后用ECL顯色試劑盒于暗室曝光顯影。

3統(tǒng)計學處理

用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA)，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果

1過表達Daxx的K562細胞系的建立

熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明，GFP-Daxx在細胞內(nèi)聚集，并表達于細胞核。實時熒光定量PCR檢測過表達細胞系Daxx的mRNA水平顯著高于對照組，Westernblot結(jié)果顯示，過表達Daxx的K562細胞中，Daxx蛋白表達明顯升高。

2過表達Daxx對K562細胞活力的影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示，過表達Daxx后K562細胞的活力明顯低于對照(K562細胞)組(P<0.01)。

3PMA誘導K562細胞向巨核細胞分化

流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示，PMA處理K562細胞后CD41和CD61的表達升高，見圖4。Westernblot實驗結(jié)果顯示，在PMA誘導K562細胞分化的過程中，p-ERK的蛋白水平升高，Daxx的表達呈下降趨勢。

4過表達Daxx對K562細胞向巨核細胞分化的影響

過表達Daxx后，PMA誘導GFD-Daxx-K562細胞向巨核細胞分化，流式細胞術(shù)檢測CD41和CD61的表達均明顯低于對照(K562細胞)組(P<0.01)。NBT還原實驗結(jié)果顯示，Daxx過表達后，分化細胞數(shù)量與對照組相比明顯降低(P<0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，過表達Daxx后，p-ERK的蛋白水平相對于對照組下降。

討論

Daxx最初發(fā)現(xiàn)它是一種受體胞漿死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，之后證實它是一種定位于細胞核亞核結(jié)構(gòu)早幼粒細胞白血病蛋白(promyelocyticleukemiaprotein，PML)癌基因結(jié)構(gòu)域(PMLocogeneicdomains，PODs)的核蛋白。Daxx廣泛分布于哺乳動物和人正常組織細胞及腫瘤細胞中，在凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、病毒感染等方面發(fā)揮重要作用。作為一種重要的信號分子，Daxx可以在細胞質(zhì)介導腫瘤壞死因子受體(tumournecrosisfactorreceptor，TNFR)超家族成員促凋亡信號的轉(zhuǎn)導，在細胞核也可以作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中行使轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活雙重功能，通過轉(zhuǎn)位、化學修飾、染色體調(diào)節(jié)、直接與轉(zhuǎn)錄因子或轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白相互作用等多種方式發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。Daxx廣泛分布于哺乳動物和人的正常細胞及腫瘤細胞，在血液病中廣泛表達，作為Fas受體胞漿死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白，Daxx可以經(jīng)Fas-Daxx-ASK1-JNK通路發(fā)揮促凋亡的作用;Daxx也可以發(fā)揮抗凋亡作用，在Daxx基因缺失的小鼠中，其胚胎干細胞發(fā)生凋亡，不能正常發(fā)育。Daxx可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白或相關(guān)因子，如E2A、Ets-1、Pax3和Pax5等，進行轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制的調(diào)控。

有研究表明，Daxx參與細胞分化，Daxx通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子E2A，抑制E2A的功能，從而抑制關(guān)鍵的肌原性基因表達和減少肌小管的形成，抑制肌細胞生成，參與肌細胞分化過程;Daxx可以促進卵巢癌細胞的生長以及其化療耐藥性，Daxx可以通過抑制自噬促進前列腺癌的發(fā)生。關(guān)于Daxx在血液腫瘤中的作用，相關(guān)研究較少。

人白血病K562細胞株是慢性粒細胞白血病的一個典型的細胞系，其在體外被相關(guān)藥物誘導后具有向巨核系、單核系或紅系等多個方向分化潛能。K562細胞可以作為巨核細胞系分化模型，PMA是蛋白激酶C(proteinkinaseC，PKC)的激動劑，K562細胞能被PMA誘導分化成為具有巨核系特征的細胞。PKC是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種信號轉(zhuǎn)導途徑，在細胞生長、分化和細胞因子分泌等過程中發(fā)揮著重要作用，ERK是經(jīng)典MAP信號轉(zhuǎn)導分子，介導多種細胞生物學過程，包括細胞生長、存活、分化和炎癥反應等。PMA誘導K562細胞向巨核細胞分化過程中，ERK信號通路通常被激活。目前研究表明，影響PMA誘導K562細胞向巨核細胞分化的因素很多，KRAB-ZFPs是一類重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，ZNF300是其典型成員，在PMA誘導K562細胞分化過程中表達上調(diào)，參與調(diào)控K562細胞巨核細胞分化。電離輻射可以促進PMA誘導的K562細胞巨核細胞分化，MAPK信號通路中ERK和P38MAPK參與此過程調(diào)控。過表達7號染色體開放閱讀框41(C7ORF41)可以促進佛波酯誘導的K562細胞巨核細胞分化，p-ERK和JNK的蛋白水平升高。在PMA誘導K562細胞巨核細胞分化過程中，線粒體功能發(fā)生明顯改變，ROS水平明顯升高，線粒體膜電位下降，呼吸鏈復合體IV活性降低。而關(guān)于Daxx與K562細胞巨核細胞分化的關(guān)聯(lián)研究目前尚未見報道。

為研究Daxx在K562細胞中的作用，建立穩(wěn)定表達Daxx的K562細胞系，CCK8實驗結(jié)果顯示，Daxx過表達后，細胞活力顯著降低。通過PMA誘導K562細胞向巨核細胞分化，發(fā)現(xiàn)在巨核細胞分化過程中p-ERK表達升高，Daxx表達下降，表明Daxx在K562細胞向巨核細胞分化過程中起抑制作用。PMA誘導Daxx-K562細胞后發(fā)現(xiàn)分化細胞數(shù)目降低，細胞巨核細胞分化指標CD41和CD61的表達顯著降低，進一步表明Daxx參與抑制K562細胞向巨核細胞分化。Westernblot結(jié)果顯示，Daxx過表達后，PMA誘導K562細胞向巨核細胞分化，p-ERK的蛋白水平降低，表明Daxx可能通過下調(diào)p-ERK來實現(xiàn)對K562細胞向巨核細胞分化的抑制，但有關(guān)深入的作用機制，還需要進一步的研究。