腫瘤細(xì)胞的遷移性與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的重要原因，因此腫瘤侵襲及遷移的機制研究與臨床腫瘤治療策略的發(fā)展密切相關(guān)。FILIP-1L(FilaminAinteractingprotein1-like，F(xiàn)ILIP-1L;previouslyknownasdown-regulatedinovariancancer1，DOC1)是在卵巢癌細(xì)胞系低表達(dá)蛋白，其功能尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)FILIP-1L與乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的侵襲負(fù)相關(guān)我們前期研究還發(fā)現(xiàn)FILIP-1L與熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(Heatshockfactor1，Hsf1)的降解有關(guān)，為了進(jìn)一步研究FILIP-1L的生物學(xué)作用，我們構(gòu)建了pGEX-4T3-FILIP-1L表達(dá)載體，應(yīng)用FILIP-1L融合蛋白免疫新西蘭大耳白兔，制備FILIP-1L多克隆抗體，為FILIP-1L生物學(xué)功能的深入研究提供有用工具。

1材料與方法

1.1材料

pGEX-4T3、pGEX-4T3-FILIP-1L(288)、pGEX-4T3-FILIP-1L(893)、PcDNA3-FLAG-FILIP-1L(893)及E.coliBL21，本實驗室保存。新西蘭大耳白兔購自河南省實驗動物中心。肝癌細(xì)胞系HepG2、smmc-7721、bel-7402、plc/prf/5及肝永生化細(xì)胞changliver購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所。GlutathionSepharse4B購自GEHealthcareBio-SciencesAB。L-GluthionReduced為SCIENTIFICRESEARCHSRECIAL產(chǎn)品。Freund'，sAdjuantComplete及Freund'，sAdjuantIncomplete購于Sigma。ActiveEsterAgrose購自Bio-Rad。ProteaseInhibitorCocktail購自Sigma。辣根過氧化酶標(biāo)記抗兔IgG為北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1GST-FILIP-1L蛋白誘導(dǎo)表達(dá)分別將pGEX-4T3、pGEX-4T3-FILIP-1L(288)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21感受態(tài)細(xì)菌。挑取單個菌落接種于1mlLB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)14h，按照1∶100的體積接種培養(yǎng)于新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37℃180r/min振蕩培養(yǎng)至A600約為0.6時，加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6h。取200μl菌液加入5×LoadingBuffer50μl，沸水浴8min;另取6ml菌液，4000r/min，4℃離心10min。棄上清，加200μlPBS重懸沉淀，再加入5×LoadingBuffer50μl，沸水浴8min。將菌液與細(xì)菌裂解液進(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，觀察GST-FILIP-1L蛋白表達(dá)。

1.2.2GST-FILIP-1L蛋白溶解性分析如上方法將pGEX-4T3-FILIP-1L質(zhì)粒轉(zhuǎn)染E.coliBL21，LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，加入終濃度為1mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6h，4000r/min，4℃離心10min，PBS洗滌菌體沉淀2次，重懸沉淀，加入溶菌酶，冰上超聲破碎，加1%TritonX-100，冰上放置30min，4℃，10000r/min，離心10min，分別收集上清和沉淀，進(jìn)行10%SDS-PAGE蛋白電泳。

1.2.3提取GST-FILIP-1L蛋白如上方法收集菌液，10000r/min，4℃離心10min，棄上清。沉淀中加入濃度為8mol/L的尿素溶液20ml，混合均勻，置冰上超聲30s，間隔30s，共6個循環(huán)。9000r/min，4℃離心10min，收集上清于透析袋內(nèi)，將透析袋置入2mol/L尿素溶液中，4℃透析過夜。將透析液更換為1×PBS，4℃透析24h，期間更換PBS液一次。收集透析袋內(nèi)液體，9000r/min，4℃離心20min，收集上清GST-FILIP-1L蛋白溶液備用。

1.2.4純化GST-FILIP-1L蛋白取GlutathionSepharse4B2ml加入PBS溶液5ml，混勻，4000r/min，4℃離心5min，棄上清。重復(fù)上述操作三次，加入1mlPBS溶液懸浮beads。將GlutathionSepharse4B懸液與上述收集的GST-FILIP-1L蛋白溶液混合，置4℃旋轉(zhuǎn)過夜。加預(yù)冷PBS液10ml，混懸，洗滌GlutathionSepharse4B，4000r/min，4℃離心5min，重復(fù)操作5次。加入GlutathionReduced緩沖液1ml，旋轉(zhuǎn)混合20min，4℃4000r/min，離心5min，將上清收集至新EP管內(nèi)。重復(fù)GlutathionReduced緩沖液洗脫，共3次。標(biāo)明洗脫液順序，檢測洗脫液蛋白純度后，置80℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.5多克隆抗體制備取新西蘭大耳白兔1只，免疫前耳緣靜脈取血作為陰性血清對照。將純化的GST-FILIP-1L(288)蛋白與弗氏完全佐劑等體積充分乳化后，于動物背部皮下多點注射，每只動物的蛋白抗原用量為400μg。初次免疫后第21天、35天分別以同劑量的GST-FILIP-1L蛋白，加弗氏不完全佐劑乳化后，采用同樣方法加強免疫2次。第二次加強免疫10d后，耳緣靜脈取血測定抗血清的效價。抗體效價達(dá)到實驗要求后，自頸總動脈插管放血，收集血液，37℃培養(yǎng)箱靜置3h，2000r/min離心10min，取血清于-80℃保存。

1.2.6間接ELISA方法檢測抗體效價用抗原稀釋液稀釋GST-FILIP-1L蛋白，使其濃度為1μg/ml，每孔加入100μl蛋白稀釋液包被96孔酶標(biāo)板。以動物免疫前血清作為陰性對照，用磷酸鹽緩沖液稀釋血清(1∶250，1∶500，1∶1000，1∶2000，1∶4000，1∶8000，1∶16000～1∶128000)，間接ELISA方法檢測抗體效價。

1.2.7多克隆抗體純化

1.2.7.1飽和硫酸銨純化抗體用PBS1∶5倍稀釋免疫動物血清，4℃緩慢逐滴加入飽和硫酸銨溶液(體積比1∶1)，4℃磁力攪拌過夜。4℃、10000r/min離心20min，PBS懸浮沉淀。PBS透析4次，每次12h，收集透析袋內(nèi)抗體溶液。

1.2.7.2去除抗GST抗體取GlutathionSepharse4B1ml，加預(yù)冷PBS液5ml，4000r/min，4℃離心5min，棄上清。PBS懸浮沉淀，重復(fù)上述操作3次。加1mlPBS液懸浮beads，加入GST蛋白5mg，4℃旋轉(zhuǎn)孵育2h，4000r/min，4℃離心5min。PBS洗5次后，加1mlPBS混懸。加入上述飽和硫酸銨純化的血清50ml，4℃旋轉(zhuǎn)孵育4h，離心，收集上清。

1.2.7.3親和層析純化抗體

(1)取ActiveEsterAgrose混懸液1ml，4000r/min，4℃離心5min，棄上清。加入預(yù)冷單蒸水1ml，混懸，4000r/min，4℃離心10min。重復(fù)上述操作5次。

(2)取純化的GST-FILIP-1L蛋白5mg于透析袋內(nèi)，將透析袋置入1mol/LHEPES溶液中，4℃透析過夜。

(3)混合ActiveEsterAgrose和GST-FILIP-1L蛋白溶液，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。4000r/min，4℃離心10min，棄上清。

(4)依次用PBS溶液10ml、0.1mol/LGlycineHCl(pH2.5)5ml、PBS溶液10ml洗滌，4000r/min，4℃離心10min。

(5)取上述處理的抗血清1ml，置56℃恒溫水浴鍋內(nèi)30min，PBS稀釋10倍，加入resin-column混合，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜，4000r/min，4℃離心10min，回收上清，沉淀進(jìn)行下述操作。

(6)分別用1×PBS、0.5mol/LNaCl、0.5%tritonX-10010ml洗滌antibody-resin-column，4000r/min4℃離心10min;轉(zhuǎn)移antibody-resin-column至柱子中，用1×PBS10ml及去離子水10ml洗滌。

(7)用0.1mol/LGlycine.HCl(pH2.5)0.9ml洗滌antibody-resin-column，收集洗脫液于干凈無菌EP管內(nèi)(EP管內(nèi)預(yù)先加入一定體積的2mol/LTris-HClpH8.0)，共洗脫3次，分管收集，分別測定每管蛋白(抗體)含量，-80℃保存?zhèn)溆谩?

1.2.8檢測多克隆抗體與目的蛋白的結(jié)合制備SDS-PAGE凝膠，加入不同劑量的純化GST-FILIP-1L融合蛋白，常規(guī)蛋白質(zhì)電泳，轉(zhuǎn)印PVDF膜。將PVDF膜置1∶50稀釋的FILIP1L抗體稀釋液中，4℃旋轉(zhuǎn)孵育過夜。TBST溶液洗膜。加入稀釋好的二抗，室溫，置搖床孵育1h�；瘜W(xué)發(fā)光顯色，于暗室中曝光、顯影。圖像掃描儀上拍照后分析。

1.2.9檢測多克隆抗體與細(xì)胞FILIP-1L蛋白結(jié)合常規(guī)培養(yǎng)293T細(xì)胞，待細(xì)胞狀態(tài)良好，按照Lipofetamine2000Reagent說明書，分別轉(zhuǎn)染PcDNA3.0及PcDNA3.0-FILIP-1L(893)質(zhì)粒，置37℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印PVDF膜。以制備的多克隆抗體為一抗，Westernblot方法檢測多抗與細(xì)胞FILIP-1L蛋白的結(jié)合。

1.2.10檢測肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白表達(dá)常規(guī)培養(yǎng)肝癌細(xì)胞HepG2、smmc-7721、bel-7402、plc/prf/5及永生化肝細(xì)胞changliver，收集生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)印PVDF膜。以制備的多克隆抗體為一抗，Westernblot方法檢測肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白表達(dá)。

2結(jié)果

2.1GST-FILIP-1L蛋白原核誘導(dǎo)表達(dá)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21菌株，挑取單克隆培養(yǎng)，IPTG誘導(dǎo)，SDSPAGE分析FILIP-1表達(dá)。結(jié)果顯示，與未加IPTG誘導(dǎo)組相比，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)化pGEX-4T3及pGEX-4T3-FILIP-1L(288)質(zhì)粒的細(xì)菌裂解后，分別在25、55kD處有明顯的蛋白條帶出現(xiàn)，但其菌液電泳后無明顯條帶顯示。表明融合蛋白誘導(dǎo)成功，且主要在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

2.2GST-FILIP-1L蛋白溶解性分析取誘導(dǎo)表達(dá)FILIP-1L的菌體洗滌后裂解，4℃，10000r/min，離心10min，分別收集上清和沉淀，并取上清液和沉淀懸液進(jìn)行10%SDS-PAGE蛋白電泳。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染FILIP-1L(288)的細(xì)菌沉淀懸液電泳后，在分子量為55kD處有明顯條帶，而上清液電泳后無明顯條帶顯示，提示FILIP-1L(288)蛋白在細(xì)胞內(nèi)主要以包涵體形式高表達(dá)[分子量應(yīng)為90kD的FILIP-1L(893)未完全表達(dá)]。

2.3GST-FILIP-1L蛋白純化原核表達(dá)的GST及GST-FILIP-1L蛋白與GlutathionSepharse4BBeads·834·中國免疫學(xué)雜志2016年第32卷結(jié)合，經(jīng)GlutathionReduced(GSH)緩沖液洗脫后，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，在分子量25、55kD處獲得了純度較高的GST及GST-FILIP-1L(288)蛋白，而分子量為90kD的GST-FILIP-1L(893)蛋白表達(dá)量及純度均較低。

2.4多克隆抗體效價用純化的FILIP-1L(288)融合蛋白包被酶標(biāo)板，間接ELISA方法檢測兔抗人FILIP-1L多克隆抗體，以大于陰性血清A450nm值4倍的最小值作為多克隆抗體效價。檢測結(jié)果表明，制備的FILIP-1L多克隆抗體效價為1∶2048000。

2.5多克隆抗體的純化利用ActiveEsterAgrose純化血清中抗FILIP-1L抗體，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，獲得了純度較高的IgG，SDS-PAGE電泳中IgG重鏈和輕鏈間的二硫鍵被打開，電泳中顯示分子量25、50kD的兩條蛋白條帶。

2.6多克隆抗體與目的蛋白結(jié)合應(yīng)用Westernblot方法，檢測制備的多克隆抗體與FILIP-1L蛋白的結(jié)合能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同劑量的GST-FILIP-1L融合蛋白(1～6泳道)與多抗孵育后均有條帶顯示，且隨著FILIP-1L蛋白量的增加，條帶逐漸增粗，但GST蛋白(第7泳道)處無條帶顯示。提示多抗與GST-FILIP-1L蛋白有良好的結(jié)合能力，但不與GST蛋白結(jié)合。

2.7多克隆抗體與細(xì)胞FILIP-1L蛋白結(jié)合293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染PcDNA3.0及PcDNA3.0-flag-FILIP-1L(893)質(zhì)粒48h，提取細(xì)胞蛋白，Westernblot檢測多克隆抗體與細(xì)胞FILIP-1L蛋白的結(jié)合，同時以Flag抗體檢測轉(zhuǎn)染FILIP-1L蛋白的表達(dá)。實驗發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染PcDNA3.0-flag-FILIP-1L(893)的細(xì)胞裂解液與多抗孵育后，在分子量95kD(轉(zhuǎn)染FILIP-1L)及110kD(細(xì)胞FILIP-1L)處均有條帶顯示;而轉(zhuǎn)染PcDNA3.0的細(xì)胞裂解液與多抗孵育后，僅在分子量110kD處有條帶顯示，分子量95kD處無條帶出現(xiàn)，提示制備的多抗能與細(xì)胞FILIP-1L蛋白及細(xì)胞轉(zhuǎn)染FILIP-1L蛋白結(jié)合。

2.8檢測肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白表達(dá)應(yīng)用制備的FILIP-1L多抗，Westernblot方法檢測不同肝癌細(xì)胞FILIP-1L蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示不同的肝癌細(xì)胞在分子量110kD處均有條帶顯示，永生化肝細(xì)胞ChangliverFILIP-1L表達(dá)量較高，而肝癌細(xì)胞HepG2、smmc-7721、Bel-7402及plc/prf/5細(xì)胞FILIP-1L表達(dá)量較低。

3討論

野生型FILIP-1L由893個氨基酸組成，含有4個雙螺旋、2個亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，在不同的細(xì)胞內(nèi)，存在有不同分子量的FILIP-1L剪切體形式。目前FILIP-1L的生物學(xué)功能尚不完全清楚，研究發(fā)現(xiàn)FILIP-1L與腫瘤轉(zhuǎn)移、血管生成有關(guān)，F(xiàn)ILIP-1L表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞系和卵巢癌的侵襲力負(fù)相關(guān)，侵襲嚴(yán)重的腫瘤組織的FILIP-1L表達(dá)較非侵襲的交界瘤組織的FILIP-1L表達(dá)顯著降低;腫瘤血管系統(tǒng)定向表達(dá)FILIP-1L蛋白，能夠抑制腫瘤生長;過表達(dá)FILIP-1也可抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，并增加細(xì)胞凋亡;腹腔內(nèi)接種FILIP-1L基因能夠抑制卵巢癌擴散至腹膜及腹腔內(nèi)器官，這些研究結(jié)果提示，F(xiàn)ILIP-1可能是細(xì)胞增殖、遷移的主要抑制劑和凋亡誘導(dǎo)劑。為了深入研究FILIP-1L在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機制，我們構(gòu)建了pGEX-4T3-FILIP-1L(288)、pGEX-4T3-FILIP-1L(893)兩個表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)化BL21菌株，IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出GST-FILIP-1L融合蛋白，并且pGEX-4T3-FILIP-1L(288)表達(dá)量明顯高于pGEX-4T3-FILIP-1L(893)。pGEX-4T3-FILIP-1L(288)、pGEX-4T3-FILIP-1L(893)均以包涵體形式表達(dá)。我們用高濃度的變性劑(8mol/L尿素)溶解包涵體，經(jīng)過透析、GlutathionSepharse4B純化，得到濃度高、純度好的GST-FILIP-1L(288)融合蛋白。我們用純化的GST-FILIP-1L(288)融合蛋白免疫新西蘭大耳白兔，應(yīng)用間接ELISA方法檢測抗血清效價，結(jié)果顯示動物血清抗體效價達(dá)到1∶2048000，提示動物接種GST-FILIP-1L(288)融合蛋白后，體內(nèi)產(chǎn)生了高滴度的抗FILIP-1L抗體。親和層析純化動物血清中FILIP-1L抗體，經(jīng)免疫印跡檢測顯示，制備的FILIP-1L抗體能夠特異結(jié)合FILIP-1L蛋白、細(xì)胞轉(zhuǎn)染FILIP-1L蛋白及細(xì)胞FILIP-1L蛋白。應(yīng)用制備的FILIP-1L抗體，WB檢測顯示永生化肝細(xì)胞changliverFILIP-1L表達(dá)量較高，而肝癌細(xì)胞hepG2、smmc-7721、bel-7402及plc/prf/5細(xì)胞FILIP-1L表達(dá)量較低。實驗結(jié)果表明我們制備的FILIP-1L抗體能夠特異識別FILIP-1L，可以用于后續(xù)的FILIP-1L功能學(xué)研究。

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤病人死亡的主要原因，F(xiàn)ILIP-1L通過抑制WNT信號通路及MMP表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移，是一個潛在的重要抗腫瘤分子。我們前期實驗還發(fā)現(xiàn)FILIP-1L是熱休克轉(zhuǎn)錄因子1的作用蛋白，參與Hsf1的降解過程。目前FILIP-1L的生物學(xué)功能尚不完全清楚，而市面上尚無性能良好的商品化抗體，我們制備的FILIP-1L抗體為深入研究FILIP-1L的生物學(xué)功能提供了有用工具。