流感嗜血桿菌包括可分型流感嗜血桿菌和不可分型流感嗜血桿菌，其中可分型流感嗜血桿菌根據(jù)莢膜多糖的結(jié)構(gòu)又分為a～f6個血清型。接種b型流感嗜血桿菌(Haemophilusinfluenzaetypeb，Hib)結(jié)合疫苗的所有國家，侵襲性Hib疾病的發(fā)病率降低了90%以上，而Hia的發(fā)病率明顯升高。Hia與Hib疾病類似，死亡率高，后遺癥嚴重。目前北美本土人群Hia發(fā)病率全球最高，1988～2003年，美國西南地區(qū)5歲以內(nèi)兒童年平均發(fā)病率為20.2/10萬。2003～2011年，美國阿拉斯加共發(fā)生兩次侵襲性Hia疾病暴發(fā)流行。借鑒Hib多糖蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗的成功經(jīng)驗，部分學(xué)者認為迫切需要制備Hia結(jié)合疫苗。
結(jié)合疫苗的游離多糖含量是質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一，有研究顯示，結(jié)合物的游離多糖含量與其免疫原性密切相關(guān)，游離多糖含量超過10%時，會降低結(jié)合物的免疫原性，因此，需要對結(jié)合物的游離多糖含量進行準(zhǔn)確定量。
載體蛋白質(zhì)對結(jié)合疫苗結(jié)合化學(xué)的選擇起重要作用，結(jié)合過程中可以選用載體蛋白質(zhì)的羧基作為結(jié)合位點，也可選擇氨基作為結(jié)合位點。對于TT，在甲醛脫毒的過程中會封閉一定量的氨基基團，反應(yīng)不易控制，從而導(dǎo)致不同批次TT的氨基含量差異較大。某些情況下可衍生載體蛋白質(zhì)，包括ADH衍生，從而獲得活性更強的肼基基團;也可用琥珀酸酐進行衍生，在氨基上連接琥珀酸基團以降低結(jié)合反應(yīng)過程中蛋白質(zhì)聚合。不同類型載體蛋白質(zhì)的表面電荷分布有較大差異，導(dǎo)致制備的結(jié)合物在電荷分布上也存在較大差異，因此，應(yīng)摸索一種適用于不同電荷分布的結(jié)合物的游離多糖含量測定方法。本實驗擬建立脫氧膽酸鈉(NaDC)鹽酸法結(jié)合蒽酮硫酸法，以適用于檢測破傷風(fēng)類毒素(tetanustoxoid，TT)、TTADH衍生物(ADHderivativeofTT，TTAH)、TT琥珀酰化衍生物(succinicanhydridederi-vativeofTT，TTSA)3種帶有不同電荷的載體制備的Hia結(jié)合物的游離多糖含量。
1材料與方法
1.1樣品Hia多糖降解物[莢膜多糖降解產(chǎn)物(depolymerizedpolysaccharide，de-PS)、批號：試De-201505003)]、Hia多糖衍生物[多糖降解物ADH衍生物(ADHderivativeofde-PS，de-PSAH)、批號：試HD-201506003)]、TT(批號：試HP-201209002)、TTAH(批號：試HD-201504003)、TTSA(批號：試HD-2015-08003)均由本公司第一研究室制備，其中Hia生產(chǎn)用菌株HK643由丹麥奧胡斯大學(xué)Dr.Kilian教授惠贈。本實驗使用的TTAH和TTSA均由TT(試HP-201209002)衍生制備。衍生物及結(jié)合物均由本公司第一研究室制備，多糖衍生物：多糖降解物經(jīng)CDAP活化后，與ADH一端的肼基連接制備;結(jié)合物(2015-06001和201508006)：EDAC縮合多糖衍生物的肼基與TT或TTSA的羧基共價結(jié)合制備;結(jié)合物(2015-06002和201506003)：CDAP活化多糖降解物后直接與TT或TTAH共價結(jié)合制備。
1.2主要試劑葡萄糖、蒽酮和NaDC均購自美國Sigma公司;鹽酸、硫酸購自白銀良友化學(xué)試劑有限公司。
1.3蛋白質(zhì)含量測定參照《中國藥典》三部(2010版) Lowry法測定蛋白質(zhì)含量。
1.4多糖含量測定參照《中國藥典》三部(2010版)蒽酮硫酸法測定多糖含量。
1.5游離多糖含量的檢測采用NaDC鹽酸法，具體參考文獻]進行。將100μl1%NaDC(pH7.3)加入1ml待檢樣品中，振蕩混勻，于2~8℃靜置30min;加入50μl1mol/LHC1，振蕩混勻，4℃，20000×g離心30min;取1ml上清，采用蒽酮硫酸法測定上清多糖含量。
1.6Hia結(jié)合物游離多糖含量測定方法的建立
1.6.1NaDC鹽酸法對蒽酮硫酸法測定多糖含量的影響將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成0、10、20、30、40、50μg/ml濃度，按1.4項方法進行檢測，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線1，計算相關(guān)系數(shù)(r2)。將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成0、11.5、23、34.5、46、57.5μg/ml濃度，按1.5項方法進行檢測，此時，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的最終濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線1一致，繪制曲線2，計算r2。
1.6.2NaDC鹽酸法沉淀TT、TTAH和TTSA最大能力的確定將TT溶液稀釋至50、100、150、200、300、400、500、600和700μg/ml，TTAH溶液稀釋至50、100、150、200、250、300、350、400和500μg/ml，TTSA溶液稀釋至50、100、150、200、250、300、400、500、600和700μg/ml，按1.5項方法處理后，采用1.3項方法分別測定上清和總的蛋白質(zhì)含量，按下式計算蛋白質(zhì)沉淀效率。
1.6.3最佳離子濃度的確定制備多糖降解物與TT或TTAH的混合物A和B，多糖衍生物與TT或TTSA的混合物C和D，多糖與蛋白質(zhì)的質(zhì)量比均為1∶1，混合物、de-PS和de-PSAH溶液均在終濃度0、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0和1.2mol/L的NaCl溶液中，多糖濃度均為60μg/ml。按1.5項方法，檢測de-PS或de-PSAH以及混合物經(jīng)NaDC鹽酸法處理后上清的多糖含量，計算多糖回收率，確定最佳氯化鈉離子強度。
1.6.4多糖與蛋白質(zhì)最小質(zhì)量比值的確定調(diào)整上述4種混合物中多糖與蛋白質(zhì)的比值，并置于0.6mol/L的NaCl溶液中，多糖濃度為60μg/ml，混合物A、C和D多糖與蛋白質(zhì)的比值為1∶2、1∶3、1∶4和1∶5，混合物B多糖與蛋白質(zhì)的比值為1∶2、1∶3和1∶4。按1.5項方法，測定混合物上清的多糖含量，計算多糖回收率，確定多糖與蛋白質(zhì)的最小比值。
1.7Hia結(jié)合物游離多糖含量測定方法的驗證
1.7.1準(zhǔn)確度參考文獻方法，以添加回收試驗即Spike試驗驗證游離多糖測定方法的準(zhǔn)確度。在終濃度0.6mol/LNaCl的離子強度下，分別向結(jié)合物(201506001和201508006批)中添加不同濃度的de-PSAH，向結(jié)合物(201506002和201506003批)中添加不同濃度的de-PS，多糖加入濃度分別為6、12、35和56μg/ml，相應(yīng)的葡萄糖含量分別為2.59、5.17、15.1和24.1μg/ml，按照1.5項方法，測定外加多糖的回收率。
1.7.2精密度在0.6mol/LNaCl的離子強度下，按照1.5項方法，測定結(jié)合物(201506001、201506-002、201506003和201508006批)的游離多糖含量，每天測定1次，共6次。
2結(jié)果
2.1NaDC鹽酸法對蒽酮硫酸法測定多糖含量的影響當(dāng)葡萄糖濃度在0～50μg/ml范圍時，未經(jīng)及經(jīng)NaDC處理繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線的620nm吸光度值一致，均具有良好的線性，斜率分別為0.00500和0.00511，r2均大于0.999，表明NaDC鹽酸法對蒽酮硫酸法測定多糖含量幾乎無影響。
2.2NaDC鹽酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的最大能力當(dāng)TT濃度在402.8μg/ml以下、TTAH濃度在352.5μg/ml以下時，蛋白質(zhì)的沉淀效率均在95%以上;當(dāng)TT濃度高于497.1μg/ml、TTAH濃度高于403.6μg/ml時，蛋白質(zhì)的沉淀效率均低于95%;當(dāng)TTSA濃度在691.0μg/ml以內(nèi)時，蛋白質(zhì)的沉淀效率均高于95%。因此，確定NaDC鹽酸法沉淀TT、TTAH和TTSA的最大能力分別為402.8、352.5和691.0μg/ml。
2.3最佳離子濃度NaDC鹽酸法處理de-PS或de-PSAH，多糖回收率均約100%，與鹽離子濃度無關(guān);但混合物的多糖回收率與鹽離子濃度密切相關(guān)，在低濃度的鹽離子強度下，多糖回收率偏低，只有將鹽離子提高至一定濃度時，才能保證多糖回收率在95%以上。當(dāng)混合物A和C的鹽離子濃度不低于0.5mol/L、混合物B的鹽離子濃度不低于0.6mol/L、混合物D的鹽離子濃度不低于0.4mol/L時，多糖回收率才能在95%以上，因此，確定最佳鹽離子濃度為0.6mol/L。
2.4多糖與蛋白質(zhì)的最小質(zhì)量比值混合物A和B質(zhì)量比為1∶2時，多糖降解物的回收率均在95%以上;混合物C質(zhì)量比為1∶2、1∶3和1∶4時，多糖衍生物的回收率均超過95%;混合物D質(zhì)量比為1∶2、1∶3、1∶4和1∶5時，多糖衍生物的回收率均不低于95%。
2.5方法的驗證
2.5.1準(zhǔn)確度向4種結(jié)合物中添加12、35和56μg/ml的de-PS或de-PSAH時，外加多糖的回收率均在90%以上，但外加6μg/ml時，實際添加的葡萄糖含量為2.59μg/ml，是測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點的1/4，添加量相對較低，誤差較大，但回收率也均在80%以上，，表明建立的方法針對不同結(jié)合物游離多糖含量的測定均具有良好的準(zhǔn)確度。
2.5.2精密度游離多糖含量檢測結(jié)果的CV均在10%以內(nèi)，表明建立的方法對不同結(jié)合物游離多糖含量的測定均有良好的精密度。
3討論
NaDC鹽酸法測定游離多糖的理論依據(jù)是在低pH值的條件下，H+與NaDC形成質(zhì)子化的簡單NaDC膠團，質(zhì)子化簡單膠團通過酸鹽結(jié)構(gòu)的強氫鍵作用使NaDC初級膠團長大，形成較大的高級膠團，甚至形成凝膠狀HnNam(Dc)n+m沉淀，從而達到測定游離多糖的目的。NaDC可以沉淀結(jié)合物及游離蛋白質(zhì)，從而有效分離游離多糖，再利用蒽酮硫酸法測定上清中游離多糖含量。理論上蒽酮硫酸法測定多糖含量時，如果有殘留的NaDC，也會參與反應(yīng)而顯色，影響檢測結(jié)果。結(jié)果證明，本方法的NaDC不影響葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，也說明本實驗條件下的NaDC對Hia游離多糖含量的測定結(jié)果無影響，這與姚靜等和沈堅等實驗結(jié)果一致。實驗中TTAH和TTSA兩種衍生物均由同一批TT制備，從衍生位點的差異可知，羧基含量由高到低為TTSA>TT>TTAH，實驗結(jié)果證明，1%NaDC對載體蛋白質(zhì)的沉淀上限由高到低也為TTSA>TT>TTAH，因此，載體蛋白質(zhì)的羧基含量越豐富，就越容易被NaDC沉淀。理論上在凝膠狀沉淀中，羧基可以與NaDC形成強氫鍵，因此蛋白質(zhì)的羧基數(shù)量越多時，可形成的強氫鍵越多，就越容易被NaDC沉淀，即在相同的實驗條件下，1%NaDC沉淀的上限值越高。
NaDC鹽酸法沉淀不同離子強度的多糖降解物
和多糖衍生物，上清多糖的回收率均約100%，與鹽離子濃度無關(guān)，而當(dāng)多糖降解物或多糖衍生物與載體蛋白質(zhì)混合時，多糖的回收率隨鹽離子濃度的升高而增加，當(dāng)鹽離子達到一定濃度時，多糖降解物回收率接近100%。相同離子強度下，多糖降解物或多糖衍生物與TT等質(zhì)量的混合物中，上清多糖回收率相似，表明多糖降解物和多糖衍生物電荷的差異對游離多糖含量的測定無明顯影響。相同離子強度下，等質(zhì)量的TT、TTAH或TTSA與多糖降解物或多糖衍生物的混合物中，回收率達到95%所需的離子濃度由高至低為TTAH>TT>TTSA，多糖的回收率與蛋白質(zhì)的衍生方式有關(guān)。Hia多糖降解物和多糖衍生物的重復(fù)單位上均含有負電荷的磷酸基團。樣品經(jīng)NaDC和鹽酸處理后，pH值約3.0。該條件下，3種蛋白質(zhì)的正電荷數(shù)量由高到低為TTAH、TT、TTSA。說明蛋白質(zhì)的氨基含量越多，所帶的正電荷越多，其與多糖降解物或多糖衍生物的結(jié)合能力就越強，上清多糖的回收率就越低，達到徹底分離所需的離子強度就越高。在多糖與蛋白質(zhì)質(zhì)量比值更低的混合物中，這一推測也得到了驗證。
本實驗依靠增加離子強度消除多糖降解物及多糖衍生物與載體蛋白質(zhì)間的相互作用，并對實驗進行了系統(tǒng)驗證。建立的操作方法快速、簡便，重復(fù)性強，準(zhǔn)確度和精密度均符合要求，適用于不同類型的載體蛋白質(zhì)制備的Hia結(jié)合物游離多糖含量的測定。