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腦海綿狀血管瘤(cerebral cavernous malformations,CCM)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的血管畸形,表現(xiàn)為成團的、竇腔狀擴張的血管,管壁無平滑肌層,僅有一層內(nèi)皮細(xì)胞組成,血管瘤間無神經(jīng)纖維組織。腦海綿狀血管瘤患病率約為0.1% ~ 0.5%,包括兩種發(fā)病形式:家族性和散發(fā)性。家族性腦海綿狀血管瘤病灶多發(fā),且病灶數(shù)量與發(fā)病年齡密切相關(guān)。主要致病基因為CCM1、CCM2和CCM3。CCM1 位于7 號染色體長臂上(7q11-q22),CCM2 位于7p13-15,CCM3 位于3q25.2-27。本研究首次發(fā)現(xiàn)CCM1 外顯子18 的移碼突變可導(dǎo)致腦多發(fā)性海綿狀血管瘤。
1 對象和方法
1.1 研究對象
患者家系來自浙江省,漢族,該對夫妻于1998 年足月順產(chǎn)一女孩,7 歲病亡,原因不明。2001 年足月順產(chǎn)一男孩,外院診斷為腦多發(fā)性海綿狀血管瘤,現(xiàn)意識不清;颊撸行,外院診斷為腦多發(fā)性海綿狀血管瘤,女方無類似病史。夫妻希望能有健康孩子,于2013 年來我院就診,選擇胚胎植入前遺傳診斷(PGD)助孕。
1.2 研究方法
1.2.1 標(biāo)本采集
采集患者及其丈夫和兒子的外周靜脈血4ml,EDTA 抗凝。
1.2.2 基因組DNA 提取
采用鹽析法提取外周血DNA。
1.2.3 PCR 擴增
PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司測合成,序列:CATCCCTGTGTATGTAGGAGTG(Sense);GGGCATTAACTG TCCATTTAGC( AntiSense),反應(yīng)體系:25μl 2×Taq Mastermix(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司),引物各0.5μl,DNA 模板0.5μl,dd H2O23.5μl。反應(yīng)條件:95℃變性5min ;95℃變性30s ;58℃退火30s ;72℃延伸30s ;30 個循環(huán);72℃延長7min ;4℃保存。1% 的瓊脂糖凝膠電泳觀察擴增結(jié)果。
1.2.4 Sanger 測序
檢測合格的PCR 產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序,測序結(jié)果在CCM1 突變數(shù)據(jù)庫比對。
2 結(jié)果
經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn),患者和兒子CCM1 基因外顯子18均發(fā)現(xiàn)序列異常,c.2011_2012delA ;p.Asn671Thrfs*36,移碼突變,導(dǎo)致密碼子提前終止。患者的妻子CCM1 基因外顯子18 未發(fā)現(xiàn)序列異常。
3 討論
CCM 發(fā)病男女比例為1 :1,平均發(fā)病年齡為30.6 歲。有37% 的患者出現(xiàn)癲癇發(fā)作,36% 有出血,23% 伴有頭痛,22% 出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損,10% 無癥狀[7]。家族性CCM 是常染色體顯性遺傳病,大約80% 的患者可檢測到CCM1/KRIT1、CCM2/MGC4607 或CCM3/ PDCD10 的突變。目前已有超過150 種CCM1、CCM2 或CCM3 的致病突變被檢測出。其中CCM1 編碼含736 個氨基酸的KRIT1 蛋白,KRIT1 蛋白是一種微管相關(guān)蛋白,含有錨蛋白結(jié)構(gòu)域,一個C 端FERM 結(jié)構(gòu)域和三個N 端NPXY 模體,定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。KRIT1 作為腫瘤抑制因子發(fā)揮作用,其缺失可導(dǎo)致海綿狀血管瘤的發(fā)生。首次報道的華人家系的CCM1 基因突變?yōu)橥怙@子19 的Q698X 終止密碼子突變,導(dǎo)致產(chǎn)生截短的KRIT1 蛋白,從而導(dǎo)致CCM 的發(fā)生。我們對CCM1 基因進(jìn)行測序, 患病的丈夫和兒子外顯子18 均發(fā)現(xiàn)序列異常,c.2011_2012delA ;p.Asn671Thrfs*36,移碼突變,導(dǎo)致下游密碼子提前終止,產(chǎn)生截短的KRIT1 蛋白,而不患病的妻子則無此突變。檢測結(jié)果在CCM1 基因突變數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索分析,c.2011_c.2012delA 改變無報道,該位點改變導(dǎo)致密碼子提前終止,臨床意義明確。研究結(jié)果證明,CCM 的發(fā)生可能與KRIT1蛋白單倍劑量不足有關(guān),這與此前文獻(xiàn)報道相一致,有助于解釋CCM 的發(fā)病機制。然而由于該對夫妻年齡偏大(女方39 歲),通過超促排卵,單精子注射及胚胎胚培養(yǎng)后,沒有得到發(fā)育到囊胚期的胚胎,沒有可進(jìn)行遺傳分析的胚胎,因此未進(jìn)行遺傳學(xué)檢測。若患者在新的IVF 周期得到可供活檢的囊胚,將在胚胎發(fā)育的第五天或第六天取外滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行檢測,從而篩選出不含此致病位點的胚胎。
綜上所述,本研究對腦多發(fā)性海綿狀血管瘤家系進(jìn)行了CCM1 基因測序,發(fā)現(xiàn)一個新的致病突變位點,位于外顯子18 的c.2011_c.2012delA,有明確的臨床意義,可作為產(chǎn)前或胚胎植入前遺傳診斷(PGD)的依據(jù)。
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