白細(xì)胞介素27(interleukin-27，IL-27)，新近發(fā)現(xiàn)的IL-6/IL-12家族的細(xì)胞因子，大部分由已活化的抗原提呈細(xì)胞(包括樹突狀以及單核巨噬細(xì)胞)產(chǎn)生，是由p28和EBI3兩個(gè)亞基構(gòu)成的異源二聚體，通過與其受體IL-27R(WSX-1/gp130)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)功能。IL-27具有親和與抗炎的特性，可以通過調(diào)節(jié)輔助T細(xì)胞的發(fā)展，抑制T細(xì)胞增殖，刺激細(xì)胞毒性T細(xì)胞的活性，誘導(dǎo)B細(xì)胞同種型的轉(zhuǎn)換，并且還參與多種自身免疫病。近年來隨著流行病學(xué)的發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)IL-27的多個(gè)位點(diǎn)與多種腫瘤密切相關(guān)，它具有抗腫瘤活性和抗血管生成活性。因而，準(zhǔn)確分析不同地區(qū)及人群中的白介素基因多態(tài)性分布，可以為基因多態(tài)性與某些疾病的發(fā)生收集更多數(shù)據(jù)并提供研究價(jià)值。我們采用SNaPshotSNP分型技術(shù)對(duì)150名廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的遺傳多態(tài)性進(jìn)行分析，將數(shù)據(jù)結(jié)果與國際人類基因組單倍型圖譜計(jì)劃(Hap-Map)公布的四個(gè)人群(歐洲、非洲、日本和中國北京人群)的SNP檢測結(jié)果對(duì)比，從而分析不同人種白介素基因的SNP是否存在差異，以期為與白介素相關(guān)的遺傳和疾病等方面的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)資料。

1資料與方法

1.1一般資料

從右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院選擇150名進(jìn)行健康體檢并且體檢結(jié)果健康者作為研究對(duì)象(2012年1～8月)。研究對(duì)象要在廣西長期居住(時(shí)間>10年)，籍貫均為廣西，民族均為壯族。在150名研究對(duì)象中，男性87名，女性63名，年齡范圍25～84歲，各項(xiàng)臨床及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)均正常。

1.2基因組DNA的提取

每位受試者抽取靜脈血2ml，使用碘化鈉法提取細(xì)胞基因組DNA，低溫保存待用。

1.3PCR技術(shù)通過在NCBI上查找到的白介素基因DNA序列，選擇包含rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的序列并輸入到Primer5引物設(shè)計(jì)軟件，從而得到用于特異性擴(kuò)增包含rs4740與rs181206位點(diǎn)白介素基因的PCR上下游引物和延伸引物。其中，rs4740位點(diǎn)的上游引物序列為:5’-CAGTGGCCCCTCTCCATCTTCT-3’，下游引物序列為:5’-CGAGGACCCAGGTGCTGTCTG-3’，延伸引物序列為:5’-TTTTTTTTTTCGGCCCCGAGCCAGGTACTAC-3’。rs181206位點(diǎn)的上游引物序列為:5’-CAGCTGCATCCTCTCCATGTTG-3’，下游引物序列為:5’-GCTGAGGTGGGGGAAGAGCTAC-3’，延伸引物序列為:5’-TTTTGGTCCCCAGCCCTCCCAGC-3’。20μL白介素基因的PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括:10×PCR反應(yīng)緩沖液2.0μL，0.3mmol/LdNTPs2.0μL，上下游引物各1.0μL，HotStarTaqDNA聚合酶1.0U，基因組DNA1.0μL，不足體積20μL用水補(bǔ)足。PCR產(chǎn)物4℃保存。PCR反應(yīng)條件為:94℃，15min;94℃×30s，60℃×30s，72℃×20s，共35個(gè)循環(huán);72℃×10min。最后PCR產(chǎn)物4℃保存。

1.4SNaPshotSNP分型技術(shù)

用ABI公司的SNaPshotMultiplexkit對(duì)經(jīng)過蝦堿酶和外切酶Ⅰ純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行延伸反應(yīng)，然后在ABI3130XL對(duì)用蝦堿酶純化后的延伸產(chǎn)物進(jìn)行上樣，最后用GeneMapper4.0(Appliedbiosystems)來分析SNP分型。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

根據(jù)測序結(jié)果直接對(duì)白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率進(jìn)行計(jì)算，并從NCBI查找到HapMap公布的白介素基因rs4740以及rs181206位點(diǎn)在四個(gè)人群(歐洲、非洲、日本和中國北京人群)的分型結(jié)果，采用SPSS17.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，對(duì)比廣西壯族人群與四個(gè)人群的基因型和等位基因頻率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn):α=0.05。

2結(jié)果

2.1白介素基因位點(diǎn)rs4740和rs181206的檢測結(jié)果包含白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小分別為250bp和248bp。從ABI3130XL的SNP分型結(jié)果中可得，rs4740位點(diǎn)的基因型有三種，分別為AA、GG和AG。rs181206位點(diǎn)的基因型有三種，分別為AA、GG和AG(該位點(diǎn)沒有基因型為G/G的樣本)。

2.2廣西壯族人群白介素基因多態(tài)性分布根據(jù)檢測結(jié)果對(duì)白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率進(jìn)行計(jì)算，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，150份樣本的白介素基因位點(diǎn)rs4740和rs181206的基因型及等位基因頻率符合Hardy-Weinberg平衡，說明研究對(duì)象可以代表中國廣西地區(qū)人群白介素基因多態(tài)性分布情況，在廣西壯族人群中，白介素基因A等位基因型在以上兩個(gè)位點(diǎn)的頻率均為最高，其中在rs4740位點(diǎn)約為51.0%，在rs181206位點(diǎn)約為53.0%;GA基因型在以上兩個(gè)位點(diǎn)最常見，其中在rs4740位點(diǎn)約為47.4%，在rs181206位點(diǎn)約為94.0%，并且可知白介素基因型及等位基因頻率男女組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3廣西壯族人群與其他四個(gè)人群白介素基因多態(tài)性的比較廣西壯族人群白介素基因多態(tài)性與其他四個(gè)人群的比較結(jié)果顯示，廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與非洲、日本人群的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與歐洲、中國北京人群的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。廣西壯族人群白介素基因rs181206位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與歐洲、非洲、日本人群以及中國北京人群的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

3討論

IL-27由p28和EBI3亞基通過二硫鍵結(jié)合形成，其基因位于第16對(duì)染色體短臂上(16p11)，具有4個(gè)內(nèi)含子和5個(gè)外顯子。早期發(fā)現(xiàn)p28單獨(dú)不能分泌，后研究發(fā)現(xiàn)兩亞基不完全同時(shí)表達(dá)，只有兩亞基同時(shí)表達(dá)才能高效分泌IL-2。IL-27是Th1類細(xì)胞因子，由可溶性受體EBI3和螺旋狀蛋白IL-27p28兩個(gè)亞基組成，通過廣泛表達(dá)于各種免疫細(xì)胞表面的IL-27受體WSX-1gp130發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。

多數(shù)相關(guān)研究證實(shí)，IL-27基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)與多種疾病具有相關(guān)性。喻紫晨采用PCR以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測160例骨肉瘤患者(研究組)和250例健康者(對(duì)照組)中IL-27基因-964A/G，2905T/C和4730T/C，得出血清IL-27p28低水平可能與骨肉瘤進(jìn)展有關(guān)，但I(xiàn)L-27基因-964A/G，2905T/C和4730T/C多態(tài)性及它們的單倍型與骨肉瘤的風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)聯(lián)。黃艷平等采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測41例初治MM患者(觀察組)和40例健康體檢者(對(duì)照組)血漿IL-27的表達(dá)，得出在初治MM中，IL-27表達(dá)下降，未發(fā)現(xiàn)總體生存時(shí)間有預(yù)測效能。馮佳等人運(yùn)用Meta分析方法綜合評(píng)價(jià)中國人群IL-27p28基因多態(tài)性與腫瘤的關(guān)系，檢索中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫等收集IL-27p28基因多態(tài)性與腫瘤相關(guān)的文獻(xiàn)。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選合適文獻(xiàn)并提取所需數(shù)據(jù)，使用軟件(Stata12.0StataCorp，CollegeStation，TX，USA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)分析，中國人群IL-27p28基因多態(tài)性rs17855750位點(diǎn)G等位基因型和GG+GT基因型可能與腫瘤遺傳易感性有關(guān)。

本研究利用SNaPshotSNP分型技術(shù)檢測150名廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型，并通過HapMap上四個(gè)人群(歐洲、非洲、日本和中國北京人群)的SNP分型數(shù)據(jù)，對(duì)比五個(gè)人群的白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率差異。通過對(duì)比結(jié)果顯示白介素基因型頻率男女組間比較差異無顯著性，說明此位點(diǎn)基因型分布與性別沒有關(guān)系;從對(duì)比廣西壯族人群位點(diǎn)rs4740與rs181206同歐洲、非洲、日本以及中國北京人群可知:廣西壯族人群白介素基因rs4740位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與非洲、日本人群的差異顯著，而與歐洲、中國北京人群的差異不明顯。廣西壯族人群白介素基因rs181206位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率與歐洲、非洲、日本人群以及中國北京人群的差異均有顯著性。因此說明白介素基因rs4740位點(diǎn)和rs181206位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率與人種有著密切關(guān)系。

研究結(jié)果不僅提供了白介素基因位點(diǎn)rs4740和rs181206在廣西壯族人群的多態(tài)性分布，并對(duì)比了白介素基因在不同人種的SNP差異，為與白介素相關(guān)的疾病研究提供了參考研究資料，也為人類學(xué)和群體遺傳學(xué)補(bǔ)充了重要數(shù)據(jù)。