Rh血型是人類紅細胞上30個紅細胞血型系統(tǒng)中第二個最具有臨床意義的血型系統(tǒng)，僅次于ABO血型，位于染色體1p34.3-36.1，主要由RHD和RHCE兩個基因組成，分別編碼D抗原和C/c、E/e抗原(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/6007)，具有復雜性和多態(tài)性。基因缺失、基因交換、錯義突變產生D變異體。D變異體主要包括弱D(weekD)、部分D(partialD)和DEL型(http://www.uniulm.de/～fwagner/RH/RB2/)。弱D由RHD基因編碼區(qū)堿基突變造成，改變的蛋白質(抗原)位于細胞膜內和膜中，抗原表達完整但是強度減弱。部分D抗原表達不完整，改變的蛋白質(抗原)位于細胞膜外其質量發(fā)生變異，與某些抗-D試劑不發(fā)生凝集反應。DEL型抗原表達不僅強度減弱，且質量也發(fā)生變化，常規(guī)血清學方法不能檢測到，只能用吸收放散試驗才能檢出。Rh血型抗原尤其是D抗原具有很強的免疫原性，D抗原不合可以免疫刺激機體產生Rh抗體，引起溶血性輸血反應以及新生兒溶血病。因此，RhD抗原表型鑒定已列為臨床輸血常規(guī)檢查項目。血清學RhD初篩為陰性，間接免疫球蛋白(IAT)確認后行RHD基因分型以鑒定是否為變異型。RhD陰性受血者盡可能輸注RHD全缺失型血液，若輸注D異體血液(含有D抗原)，可刺激受血者免疫產生RhD抗體，導致臨床發(fā)生輸血不良反應。通過新鄉(xiāng)地區(qū)RhD陰性無償獻血者RHD基因多態(tài)性分析，了解本地區(qū)RHD基因變異體分布情況，構建本地區(qū)RHD基因變異體資料庫，有助于指導臨床進行RhD陰性受血者科學、合理、安全、有效輸血。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

(1)儀器:血清學專用離心機、KA-2200小型臺式離心機型(日本久保田公司)、核酸蛋白測定儀(美國Eppendorf公司)、PCR擴增儀(德國WhatmanBiometra公司)、電泳儀(北京六一機器廠)、凝膠成像系統(tǒng)(美國UVP公司)。

(2)試劑:抗-A、抗-B、IgG單克隆抗-D、抗-E、抗-C、抗-c、抗-e、抗球蛋白試劑均由上海血液生物醫(yī)藥有限責任公司提供;IgG+IgM抗-D(美國Immucor公司)，IgG+IgM抗-D(DIAGAST公司)、血液基因組提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)、人類紅細胞RHD陰性鑒定基因檢測試劑盒(天津市秀鵬生物技術開發(fā)有限公司)、dNTP(北京天根生化科技有限公司)、DNATaq酶(美國Promega公司)、M2000(大連寶生物工程有限公司)。

1.2血樣和血清學檢測

2014年9月-2014年12月間新鄉(xiāng)市血液中心在37400份血液中通過血清學試驗篩選出RhD陰性供血者48例(RhD陰性率為0.128%)，各抽取EDTA-K2抗凝血2ml，-20℃保存。所有血樣再次用微量板進行RhD抗原初篩，同樣用3種不同廠家的抗D試劑通過間接抗球蛋白證實為RhD陰性。

1.3基因組提取及PCR擴增按試劑說明書提取

基因組DNA，dsDNA濃度范圍在30～100ng/μl，A260/A280的OD值在1.7～2.0之間。PCR擴增體系按說明書配制混合液(80μldNTP-Buffer工作液+0.8μlTaq酶+10μlDNA)，再向每個引物孔(1～8孔)各加入10μl上述混合液。PCR擴增程序:96℃預變性2min，96℃變性20s，68℃60s，共5個循環(huán);96℃變性20s后，65℃50s，然后72℃45s，10個循環(huán);96℃變性20s后，62℃50s，然后72℃45s，18個循環(huán);最后72℃延伸5min，4℃保存。然后取10μl擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠(含EB)電泳，120V電泳18min，全自動凝膠成像儀成相保存結果。RHD陰性鑒定基因檢測試劑盒結果分型1。

1.4統(tǒng)計學分析RH陰性變異型的頻率采用直接計數(shù)法。

2結果

2.1Rh陰性PCR-SSP結果通過PCR-SSP(序列特異性引物聚合酶鏈反應)對48例RhD陰性無償獻血者進行RHD基因鑒定，所擴基因片段大小依據(jù)基因分型結果參照表判斷RHD基因型，發(fā)現(xiàn)新鄉(xiāng)地區(qū)存在RHD全缺失型、DELRHD1227A雜合型、RHD-CE(2-9)-D和不確定型。48例RhD陰性無償獻血者RHD基因分型。

2.2RHD基因頻率和ABO、Rh表型分布48例新鄉(xiāng)地區(qū)RhD陰性無償獻血漢人RHD全缺失型30例(62.5%)，DELRHD1227A雜合型12例(25.0%)，RHD-CE(2-9)-D4例(8.3%)，2例有EXON1、845G、D9特異性擴增，不能判斷其變異類型。RHD變異型ABO和Rh抗原表型分型發(fā)現(xiàn)A型12例(25.0%)、B型24例(50.0%)、O型12例(25.0%);ccdee29例(60.4%)、Ccdee14例(29.2%)、CCdee3例(6.3%)、ccdEe2例(4.2%)。

2.3不同種族和地區(qū)人群的RHD變異型差異。

3討論

血清學技術檢測Rh血型，在預防新生兒溶血病和避免臨床輸血不良反應中起著很重要作用。臨床由于抗D單克隆抗體試劑特異性識別相應抗原表位所限以及胎兒RhD血型判定時標本采集困難，造成D變異型、DEL及weakD往往難以得到正確結果。Rh血型系統(tǒng)具有RHD、RHCE雙基因結構，各由10個外顯子組成，二者有43個堿基有差異，其中第1、2、8外顯子序列基本一致，并且RHD、RHCE相隔很近(約有3萬bp)，在RH座位上方向相反，同源基因之間發(fā)生交換的機率很大。D基因完全缺失(10個外顯子全部缺失)導致了D抗原的不表達，Rh真陰性;或者D基因的部分缺失(有兩邊缺失和中間缺失，基因交換形成的融合等位基因)導致D抗原的不表達，如RHD-CE(1-9)-D、RHD-CE(3-7)-D、RHD-CE(8-9)-D等;D基因完整存在，但堿基突變、缺失、mRNA拼接位點變異等導致D抗原不表達，如RHD1227A、RHD(IVS3+1g﹥a)、RHD(M2951)等。國內外RHD基因變異型分子結構(基因缺失、基因交換、錯義突變)存在著地區(qū)和種族差異。本研究發(fā)現(xiàn)，新鄉(xiāng)地區(qū)RHD基因型全缺失型(62.5%)與YeSH等研究的結果一致，由錯義突變引起的DELRHD1227A雜合型占25.0%，RHD與RHCE基因交換引起的RHD-CE(2-9)-D占8.3%，與中國北方漢族人群相符，但與YeL等報道的中國南方地區(qū)差異性較大，上海地區(qū)主要表現(xiàn)為部分D變異體DVI。RHD(1227G>A)頻率與國外ScottSA等報道的高加索人有差異，變異型類型與CruzBR等報道的常見的變異型弱D4.2(DAR)及St-LouisM等報道的DELRHD*(93-94insT)相比，本地區(qū)與國外RHD變異類型及頻率差別較大。且RHD變異型可引起同種免疫反應，DELRHD*(93-94insT)作為供者輸入D陰性受者體內產生抗-D，RHD*DAU4(部分D，血清學檢測為D+)作為受者輸注RHD+紅細胞后產生同種抗體，發(fā)生溶血性輸血反應。

Rh陰性表型頻率白種人占15%～17%，非洲人占5%，亞洲人少于0.5%，本地區(qū)占0.128%，為了保證輸血安全，加拿大血液中心將所有的D變異型作為作為陽性供者，但就本地區(qū)而言，D陰性表型比率較低及變異型與國外的差異，受者RHD變異型不產生同種免疫時，可輸注D+血液，減少對Rh陰性血的需求，節(jié)約Rh陰性血。我們將進一步研究本地區(qū)的DEL作為受者時是否可作為陽性血，合理利用血液資源。

對本地區(qū)Rh陰性無償供血者行RHD基因分型，進而正確區(qū)分RH全缺失型、部分D、弱D和DEL，以及發(fā)現(xiàn)新的RH變異型，以避免RHD錯誤定型，對不能明確其變異類型的樣本我們將進一步測序。由于只統(tǒng)計了新鄉(xiāng)地區(qū)近4個月的無償獻血者，受此時段RhD陰性獻血人群的限制，我們只收集到48例RhD陰性標本，Rh陰性表型頻率較低(0.128%)，不足以完全代表本地區(qū)RHD變異類型，但也能反映新鄉(xiāng)地區(qū)存在著RHD基因型全缺失型、DELRHD1227A、RHD-CE(2-9)-D等RHD變異型，后繼可繼續(xù)增加無償獻血者個人資料，完善本地區(qū)RHD變異型資料，此為血液中心貯血和RhD陰性患者緊急輸血提供幫助。