CYP3A4是CYP3A亞家族中最主要的成員，占P450酶系總量的30%～40%，主要分布在肝臟和腸道。它參與了許多藥物和外源性毒物的氧化代謝，可代謝約50%的臨床常用藥物。研究表明，人肝臟中CYP3A4的表達(dá)及其活性存在著明顯的個(gè)體差異，并且這種差異90%與遺傳多態(tài)性有關(guān)。CYP3A4*1G(rs2242480)是CYP3A4內(nèi)含子10中的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)，其等位基因頻率在亞洲和南非人群中超過20%。研究表明CYP3A4*1G與阿托伐他汀、環(huán)孢霉素、他克莫司、芬太尼等藥物的劑量、療效及藥代動(dòng)力學(xué)改變有關(guān)。前期體外研究發(fā)現(xiàn)，在HepG2細(xì)胞中CYP3A4內(nèi)含子10具有啟動(dòng)子活性，并被CYP3A4*1G等位基因依賴性調(diào)控，但CYP3A4*1G調(diào)控的CYP3A4內(nèi)含子10與CYP3A4基因表達(dá)之間的關(guān)系尚不清楚。該研究分別構(gòu)建了由CYP3A4啟動(dòng)子和CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動(dòng)的CYP3A4真核表達(dá)載體，并將其轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，檢測(cè)CYP3A4mRNA的表達(dá)情況。

1材料與方法

1.1材料

pcDNA3.1/Hygro(+)空質(zhì)粒、pGEMCYP3A4為浙江大學(xué)藥學(xué)院藥物分析與藥物代謝研究室曾蘇教授惠贈(zèng)。攜帶CYP3A4*1G(GG/AA)的基因組DNA來自河南漢族健康志愿者，由鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理教研室保存。質(zhì)粒小提試劑盒(Axygen公司)，膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)，限制性內(nèi)切酶(NEB公司)，T4DNA連接酶(TaKaRa公司)，PrimeSTARMaxDNA聚合酶、感受態(tài)DH5α和反轉(zhuǎn)錄試劑;TriPureIsolation試劑(羅氏公司);SYBRSELECTMASTERMIX(Life公司)、Invitrogenlip2000。PCR引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。儀器設(shè)備主要有超凈工作臺(tái)、PCR擴(kuò)增儀、Nano-Drop2000c分光光度計(jì)、37℃搖床、離心機(jī)、水平電泳儀、ABI7500Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀等。

1.2質(zhì)粒擴(kuò)增

將pcDNA3.1/Hygro(+)空質(zhì)粒、pGEM-CYP3A4質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，使其隨細(xì)胞的繁殖而復(fù)制擴(kuò)增，然后用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒并測(cè)定濃度備用。

1.3目的片段的擴(kuò)增、純化及回收根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CYP3A4cDNA(NM_017460.5)設(shè)計(jì)引物，在上、下游引物的5'端分別加上EcoRV和XbaⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中CYP3A4基因(AF280107)5'端上游啟動(dòng)子區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，在上、下游引物的5'端分別加上MluⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。根據(jù)CYP3A4基因(AF280107)內(nèi)含子10全長序列設(shè)計(jì)引物，在上、下游引物的5'端分別加上MluⅠ和NheⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。PCR引物序列見表1。擴(kuò)增CYP3A4cDNA所用模板為pGEM-CYP3A4質(zhì)粒DNA，擴(kuò)增CYP3A4啟動(dòng)子、CYP3A4內(nèi)含子10所用模板為人類基因組DNA。PCR反應(yīng)體系:PrimeSTARMaxDNA聚合酶(2×)25μL，上、下游引物各3μL，模板DNA4μL，超純水補(bǔ)至50μL。反應(yīng)條件為98℃10s，65℃15s，72℃2min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10g/L瓊脂糖凝膠電泳后，按膠回收試劑盒說明書操作，回收目的片段并測(cè)濃度。

1.4pcDNA3.1-3A4重組質(zhì)粒的構(gòu)建

用EcoRV和XbaⅠ雙酶切空質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(+)、PCR產(chǎn)物CYP3A4cDNA片段，純化回收后測(cè)DNA濃度，16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂在含氨芐青霉素(100mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上，根據(jù)培養(yǎng)板菌落生長情況挑取單克隆，提取質(zhì)粒DNA，用BamHⅠ進(jìn)行酶切驗(yàn)證。陽性質(zhì)粒pcDNA3.1-3A4送立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.5CYP3A4啟動(dòng)子及CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動(dòng)的真核表達(dá)載體的構(gòu)建

用MluⅠ和NheⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3A4、PCR產(chǎn)物CYP3A4啟動(dòng)子及內(nèi)含子10DNA片段，純化回收測(cè)DNA濃度，16℃連接過夜。然后轉(zhuǎn)化、篩選、提取質(zhì)粒，質(zhì)粒DNA用MluⅠ和NheⅠ雙酶切驗(yàn)證。陽性質(zhì)粒pcDNA3.1-P3A4(CYP3A4啟動(dòng)子重組質(zhì)粒)、pcDNA3.1-W3A4(CYP3A4內(nèi)含子10野生型重組質(zhì)粒)和pcDNA3.1-M3A4(CYP3A4內(nèi)含子10突變型重組質(zhì)粒)送立菲生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用DNAMAN軟件與預(yù)期序列比對(duì)。

1.6重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CYP3A4mRNA的檢測(cè)

將按1.5方法構(gòu)建的3種質(zhì)粒及空質(zhì)粒pcDNA3.1/Hygro(+)分別轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)CYP3A4mRNA的表達(dá)水平。以GAPDH為內(nèi)參，用ΔΔCT法計(jì)算CYP3A4mRNA表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)

處理應(yīng)用SPSS21.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，4組間CYP3A4mRNA表達(dá)水平的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2結(jié)果

2.1構(gòu)建的重組質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒pcDNA3.1-3A4的BamHⅠ酶切結(jié)果見圖2，目的條帶介于500bp與750bp之間。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-P3A4、pcDNA3.1-W3A4、pcDNA3.1-M3A4的MluⅠ和NheⅠ雙酶切結(jié)果，目的條帶介于1000bp與2000bp之間。酶切結(jié)果均與預(yù)期片段長度相符。測(cè)序結(jié)果顯示均正確。

2.2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中CYP3A4mRNA表達(dá)水平的比較4種重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中CYP3A4mRNA表達(dá)水平測(cè)定結(jié)果見表2。

3討論

啟動(dòng)子一般位于基因的上游，能夠與RNA聚合酶特異性結(jié)合從而啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。研究發(fā)現(xiàn)，一個(gè)基因的表達(dá)可以同時(shí)受多個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控，且不同的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄效率不同。有研究報(bào)道一些內(nèi)含子具有啟動(dòng)子活性，可調(diào)控基因的表達(dá)。該課題組前期通過雙熒光素酶報(bào)告基因研究發(fā)現(xiàn)，與藥物代謝密切相關(guān)的CYP3A4基因，除了5'端啟動(dòng)子外，其內(nèi)含子10也具有啟動(dòng)子功能，并具有CYP3A4*1G等位基因依賴性�；�因的表達(dá)往往受多方面因素的影響，構(gòu)建cDNA重組質(zhì)粒并用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染可以排除其他調(diào)控序列對(duì)目的基因表達(dá)的干擾，從而有效地驗(yàn)證某一DNA片段或SNP對(duì)目的基因表達(dá)的影響。有文獻(xiàn)報(bào)道將內(nèi)含子嵌入真核表達(dá)載體，可通過測(cè)定外源基因的表達(dá)研究其功能。為驗(yàn)證CYP3A4內(nèi)含子10是否對(duì)CYP3A4基因表達(dá)有影響，該研究構(gòu)建了一系列真核表達(dá)載體。

重組質(zhì)粒中的目的片段是否正確連入載體，需要經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證。在測(cè)序之前往往先進(jìn)行菌液PCR或酶切初步驗(yàn)證。菌液PCR在初篩過程中比較方便而且更為經(jīng)濟(jì)，但可能存在非特異性擴(kuò)增，導(dǎo)致假陽性，不如酶切結(jié)果可靠。該研究采用酶切驗(yàn)證。值得注意的是，由于pcDNA3.1-3A4重組質(zhì)粒構(gòu)建完成后，XbaⅠ酶切位點(diǎn)前方5’端插入了兩個(gè)堿基GA，形成了GATC序列，該序列能夠被Dam甲基化酶識(shí)別，在腺嘌呤N6位置引入甲基，從而導(dǎo)致酶切受阻形成假陰性。為此，實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行BamHⅠ單酶切驗(yàn)證。由于pcDNA3.1/Hygro(+)空質(zhì)粒與CYP3A4cDNA各有一個(gè)BamHⅠ酶切位點(diǎn)，CYP3A4cDNA插入EcoRV-XbaⅠ處后，二者相距686bp，用BamHⅠ酶切后電泳圖上顯示酶切結(jié)果介于500bp與750bp之間者為陽性。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CYP3A4內(nèi)含子10能夠有效地啟動(dòng)CYP3A4基因的表達(dá)，并存在CYP3A4*1G等位基因依賴性，CYP3A4*1G突變型(AA)啟動(dòng)子活性低于野生型(GG)。

總之，該研究成功構(gòu)建了由CYP3A4啟動(dòng)子及CYP3A4*1G依賴的CYP3A4內(nèi)含子10啟動(dòng)的CYP3A4真核表達(dá)載體，并從細(xì)胞水平進(jìn)一步證實(shí)了CYP3A4*1G依賴的內(nèi)含子10可啟動(dòng)CYP3A4mRNA的表達(dá)，為CYP3A4內(nèi)含子10及CYP3A4*1G的功能與機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，為從內(nèi)含子基因調(diào)控角度闡明CYP3A4酶活性的個(gè)體差異提供了新的理論依據(jù)。