結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberoussclerosiscomplex，TSC)是一種常染色體顯性遺傳病，以全身多種組織器官出現(xiàn)錯構(gòu)瘤樣增生為特征，最易累及腦部、皮膚、和腎臟。該疾病具有遺傳異質(zhì)性，致病基因包擴TSC1(MIM605284)和TSC2(MIM191092)。TSC1基因定位于9q34.13，編碼含1164個氨基酸、分子量為130kD的蛋白產(chǎn)物，稱為錯構(gòu)瘤蛋白(hamartin)。TSC2基因定位于16p13.3，編碼1807個氨基酸、分子量為200kD的蛋白產(chǎn)物，稱為馬鈴薯球蛋白(tutberin)。Tuberin與hamartin蛋白在胞內(nèi)形成復(fù)合物，該復(fù)合物通過tuberin蛋白調(diào)節(jié)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體(mTOR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路從而調(diào)控細胞的生長和增殖�；蚧�因突變均TSC1TSC2可導(dǎo)致tuberin與hamartin復(fù)合體功能缺陷，mTOR信號通路異常激活，從而導(dǎo)致結(jié)節(jié)性硬化癥的發(fā)生。根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫專業(yè)版的統(tǒng)計，截止至2015年4月，該數(shù)據(jù)庫共記錄了TSC1基因突變303種，TSC2基因突變969種。TSC1和TSC2突變類型均以堿基置換導(dǎo)致的錯義和無義突變?yōu)橹�，TSC2基因易發(fā)生大片段的缺失及基因重組，但這在TSC1基因較為罕見。無論是散發(fā)病例還是家系患者，致病突變多見于TSC2基因。此外，兩種基因無明顯的突變熱點區(qū)域，突變廣泛分布于編碼區(qū)。本研究采用PCR和DNA測序的方法對一例中國漢族結(jié)節(jié)性硬化癥家系的先證者進行TSC2和TSC1基因的突變檢測，旨在對該家系進行致病突變篩查和進一步確定診斷，并為TSC致病機制的研究提供依據(jù)。
1　材料和方法
1.1研究對象
我們收集了1個中國漢族結(jié)節(jié)性硬化癥家系中先證者的外周靜脈血樣，該患者18歲，女，7-8歲發(fā)病，具有面部血管纖維瘤和癲癇癥狀，為家族遺傳性，先證者父親也為受累患者，未能收集到其他臨床資料�；颊呔�簽署知情同意書。
1.2基因組DNA提取
取患者III-1枸櫞酸鈉抗凝處理的外周靜脈血250μl，選用UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0(TaKaRa)試劑盒提取基因組DNA，置于-20℃保存。
1.3PCR擴增致病基因及測序分析
在UCSC網(wǎng)站獲得TSC1及TSC2基因的DNA序列，使用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計覆蓋該基因編碼區(qū)(包括外顯子和內(nèi)含子交界區(qū))的引物，引物均由生物工程(上海)股份有限公司合成。其中擴增TSC2基因外顯子15的引物序列為：上游5'-GAATACCGACTGCCATTTCT-3'，下游5'-AGGTGGGAGTGTGAAGAATG-3'。首先對先證者III-1進行檢測，PCR擴增該患者TSC2和TSC1基因的全部外顯子，PCR反應(yīng)2+體系為2×GCBufferI(MgPlus)25μl，dNTPMixture(各2.5mmol/L)8μl，上下游引物終濃度為0.5μmol/L，TaKaRaLATaq2.5U，基因組DNA約100ng，加ddHO至50μl。PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳2·150·解剖科學(xué)進展2016年第22卷第2期Fig1.PedigreeofTSCfamily檢測，切膠純化后對PCR產(chǎn)物進行Sanger測序分析。利用UCSC數(shù)據(jù)庫Blat功能對測得的DNA序列進行比對分析。
1.4核酸限制性內(nèi)切酶檢測驗證
對未報道的新突變c.1556C>T，在患者及120名無關(guān)正常個體中進行酶切驗證，以排除多態(tài)性。采用錯配引物方法，使突變的個體引入限制性內(nèi)切酶的酶切位點。用錯配引物對先證者及120名正常個體進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過限制性內(nèi)切酶酶切消化過夜，酶切產(chǎn)物進行8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。
1.5片段克隆測序
由于未獲得先證者雙親外周血樣本，為鑒定先證者樣品中的兩個突變是分別繼承自父母雙方，還是均來自先證者的受累父親，利用TaKaRaAgaroseGelDNAPurificationKit，對先證者的TSC1第15外顯子PCR產(chǎn)物進行純化，純化后的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體16℃連接過夜，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，取150ul菌液均勻涂布于氨芐青霉素-LB平板培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)，利用載體通用引物M13-47和TSC1基因外顯子15的下游引物進行菌落PCR，陽性克隆擴增培養(yǎng)后，送博邁德生物技術(shù)有限公司進行測序。
2　結(jié)果
2.1DNA測序結(jié)果
DNA測序結(jié)果顯示先證者TSC1基因第15外顯子有兩個位點突變，第一個突變是錯義突變c.1556C>T，該突變導(dǎo)致第519位氨基酸由蘇氨酸變成異亮氨酸(p.Thr519Ile)，檢索基因突變數(shù)據(jù)庫和相關(guān)文獻，該突變?yōu)閲�際上尚未報道的新突變;第二處突變是微小缺失突變c.1888_1891delAAAG，該突變導(dǎo)致第630位氨基酸由賴氨酸變?yōu)楣劝滨０凡⑶野l(fā)生移碼從而形成提前的翻譯終止密碼(p.Lys630Glnfs*22)，為已經(jīng)報道過的致病突變位點。該先證者TSC2基因測序結(jié)果未見異常。
2.2限制性內(nèi)切酶驗證結(jié)果
設(shè)計錯配引物，使c.1556C>T突變的個體引入一個BamHI酶切位點。應(yīng)用錯配引物對先證者及120名正常個體進行擴增，PCR產(chǎn)物經(jīng)過BamHI酶切，結(jié)果顯示患者的PCR產(chǎn)物部分被切開為226bp和26bp，由于26bp片段過短，因此患者在凝膠上顯示為252bp和226bp兩條條帶，而正常個體均不被切開，顯示為252bp的單一條帶。
2.3片段克隆測序結(jié)果
先證者第15外顯子DNA克隆測序結(jié)果顯示，兩個突變均來自于同一個等位基因。
3　討論
TSC是一種累及多個系統(tǒng)的遺傳性疾病，可發(fā)生多個器官的錯構(gòu)瘤，包括腦，心臟，腎臟，皮膚，眼部，肺和肝臟等，發(fā)病率約為1:10,000至1:6,000，外顯率高，但TSC臨床表現(xiàn)變異較大，不同患者及同一家系內(nèi)不同個體臨床變現(xiàn)也存在差異，因此疾病預(yù)后情況可有明顯差異。該疾病主要依靠臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查進行診斷，因此分子遺傳學(xué)分析可為患者提供早期診斷，早期干預(yù)改善預(yù)后。本研究對一個結(jié)節(jié)性硬化癥家系先證者進行TSC1和TSC2基因突變分析，發(fā)現(xiàn)該患者同時存在TSC1基因的兩個突變，即c.1556C>T和c.1888_1891delAAAG。錯義突變c.1556C>T，為國際上首次報道，該突變導(dǎo)致519位的極性的蘇氨酸被疏水的非極性異亮氨酸代替。粘著斑激酶家族互作蛋白(FIP200)可通過與TSC1的第403-787位氨基酸區(qū)域相互作用進而調(diào)控TSC1-TSC2復(fù)合體的功能，上調(diào)S6激酶的磷酸化水平，該突變位于FIP200與TSC1的結(jié)合區(qū)域，很可能影響二者的結(jié)合。本例另一微小缺失突變c.1888_1891delAAAG，根據(jù)LeidenOpenVariationDatabase數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，該突變被報道過41次，可能為高頻突變，突變后影響了開放閱讀框造成移碼，預(yù)測將在第652位產(chǎn)生提前的終止密碼。TSC1通過C末端(693–1164位氨基酸)與TSC2相互作用形成TSC1-TSC2復(fù)合體，分析該突變一方面可能引起無義突變介導(dǎo)的mRNA降解，另一方面也可能產(chǎn)生截短蛋白，丟失了與TSC2相互作用的結(jié)構(gòu)域，無法與TSC2形成復(fù)合體，進而導(dǎo)致mTOR信號途徑異常。該家系的兩個突變位點是否分別或共同起到致病作用，仍需進一步在細胞或動物水平進行研究。
克隆測序結(jié)果顯示該患者的兩個突變位于同一個等位基因上，符合常染色體顯性遺傳方式，因此這兩個突變很可能是導(dǎo)致該家系患病的致病突變，同一患者同一個TSC1等位基因上存在兩個突變情況較為罕見，本研究擴充了TSC基因突變數(shù)據(jù)庫，同時為患者提供了基因診斷，明確了病因，對該家系其他成員的診斷和遺傳咨詢具有重要意義。