出生缺陷(birth defects，BD) 是我國嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題和社會問題，每年新增出生缺陷約90 萬例。葉酸攝入不足或不能被機(jī)體有效利用是導(dǎo)致出生缺陷的主要原因。5，10- 亞甲基四氫葉酸還原酶(5，10-methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR) 和甲硫氨酸合成酶還原酶(5-methyltetrahydrofolate-homocysteinemethyltransferase reductase，MTRR)是參與體內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，其基因多態(tài)性會影響體內(nèi)葉酸及同型半胱氨酸水平，與神經(jīng)管畸形、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、妊娠期高血壓等疾病的發(fā)生密切相關(guān)，嚴(yán)重影響母嬰健康。本研究針對天津市女性，開展流行病學(xué)調(diào)查，旨在闡明本地區(qū)人群的遺傳特征，為個體化的孕期保健提供依據(jù)。

1　資料與方法

1.1　臨床資料

選取自2012年5月至2015年5月在天津市婦女兒童保健中心進(jìn)行孕前與孕期檢查的健康女性，入組對象共467例，平均年齡(29.81±4.15)歲。根據(jù)知情同意原則，采集口腔粘膜細(xì)胞。

1.2　方法

利用硅膠吸附法收集口腔粘膜上皮細(xì)胞，提取樣本的基因組DNA。通過熒光定量PCR 技術(shù)(儀器購于美國ABI 公司)，檢測MTHFR C677T、A1298C 和MTRR A66G的基因多態(tài)性。反應(yīng)體系(10 μl)：20 ng/μl DNA 模板(1μl)，Taqman Universal Master Mix(5 μl)，Taqman-MGB探針(見表1)(0.5 μl)，DEPC 水(3.5 μl)。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，92℃變性15 s，60℃延伸1 min，20 個循環(huán);89℃變性15 s，60℃延伸90 s，30 個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后在ABI7900 型熒光定量PCR 儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，采用分析軟件SDS 2.3 確定各個樣本的基因分型結(jié)果，采用Hardy-Weinberg 平衡分析MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 基因多態(tài)性。

1.3　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS19.0 軟件進(jìn)行SNPs 的Hardy-Weinberg 平衡的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，Haplo View4.2 軟件進(jìn)行單倍型結(jié)構(gòu)和LD 水平分析。計(jì)數(shù)資料采用率表示，對基因型及等位基因的頻率進(jìn)行χ2 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1　Hardy-Weinberg平衡分析

MTHFR C677T、A1298C 和MTRR A66G 基因多態(tài)性，檢驗(yàn)結(jié)果符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡(χ2 分別是0.79、0.21、2.19，P 均> 0.05)，表明樣本具有本區(qū)域的群體代表性。

2.2　天津市女性MTHFR、MTRR基因型和等位基因頻率與不同地區(qū)女性比較

天津市女性MTHFRC677T 位點(diǎn)的基因型頻率與德陽、松滋、湘潭、昆明、惠州、南寧、瓊海的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均< 0.01);A1298C 位點(diǎn)的基因型頻率與南寧、瓊海的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均< 0.05);MTRRA66G 位點(diǎn)的基因型頻率僅與瓊海的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)

天津市女性MTHFRC677T 位點(diǎn)的等位基因型頻率與德陽、松滋、湘潭、昆明、惠州、南寧、瓊海的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均< 0.01);A1298C 位點(diǎn)的等位基因型頻率與南寧、瓊海的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 均< 0.05);MTRR A66G 位點(diǎn)的等位基因型頻率僅與瓊海的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.05)

2.3　天津市女性MTHFR C677T和A1298C兩位點(diǎn)的連鎖情況及單倍型分析

天津市女性MTHFR C677T 和A1298C 兩位點(diǎn)組合情況(表2)顯示，TT/AA 組合所占比例最多，達(dá)32.9%，CT/AA 組合次之，占30.8%，不存在TT/CC 與CT/CC 兩種組合，具有一定的地區(qū)代表性。通過單倍型分析，結(jié)果顯示，天津市女性中存在4 種組合：TA(56.5%)、CC(28.7%)、CA(14.7%)、TC(0.1%)。兩位點(diǎn)間高度連鎖不平衡(D′=0.984，r2=0.22).

3　討論

出生缺陷的發(fā)生受環(huán)境、營養(yǎng)和遺傳因素的共同影響。作為參與體內(nèi)葉酸代謝的關(guān)鍵酶，MTHFR C677T 和A1298C 位點(diǎn)的多態(tài)性會降低酶活性，影響葉酸代謝和利用，與神經(jīng)管畸形、唇腭裂、先天性心臟病、唐氏綜合征等出生缺陷，以及妊娠期高血壓、復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等孕期疾病密切相關(guān)。導(dǎo)致MTHFR 酶活性降低。雙雜合子個體677CT 和1298AC 存在協(xié)同作用，與僅含C677T 突變的個體相比，同型半胱氨酸濃度顯著升高。本研究顯示天津女性這兩個位點(diǎn)的雙雜合子占16.4%。

在張婷等人所報(bào)道中，通過677CT 和1298AC 連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，貴州地區(qū)布依族和苗族兩位點(diǎn)間存在完全連鎖不平衡現(xiàn)象(D′=1)，而侗族卻未見已報(bào)道的兩位點(diǎn)連鎖不平衡現(xiàn)象，本研究表明天津市女性MTHFRC677T 和A1298C 兩位點(diǎn)間(D′=0.984，r2=0.22)為高度連鎖不平衡。天津女性易感基因MTHFR C677T、A1298C和MTRR A66G 位點(diǎn)多態(tài)性與其他地區(qū)女性的頻率存在差異。研究表明，677T 基因型孕齡女性在低葉酸飲食及未服用葉酸增補(bǔ)劑的情況下，其胎兒唇腭裂的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)均會增加，若以上兩種情況同時(shí)存在，則風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)一步增高。反之，如果能夠補(bǔ)服葉酸增補(bǔ)劑、提高飲食中葉酸的含量則可以降低胎兒唇腭裂的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。

本研究對MTHFR C677T 和A1298C 兩位點(diǎn)均進(jìn)行了單倍型連鎖不平衡研究。理論上，連鎖不平衡性隨著遺傳距離的增加而下降，通過兩位點(diǎn)中每兩個位點(diǎn)之間的單倍型連鎖不平衡，我們發(fā)現(xiàn)根據(jù)r2 值(0.22)可知677-1298其連鎖強(qiáng)度不高。因?yàn)閱伪缎偷谋Ａ舨粌H可以自發(fā)性地保留同時(shí)也可以通過與其它等位基因重組來延續(xù)。

目前的孕期保健措施是從孕前3 個月到孕早期3 個月，每天增補(bǔ)葉酸0.4mg。對于那些由于易感基因多態(tài)性造成葉酸代謝障礙的人群，在補(bǔ)充相同劑量葉酸的情況下，血漿葉酸的濃度較正常人低，同型半胱氨酸水平明顯升高。因此，通過對育齡女性進(jìn)行遺傳篩查，針對存在葉酸代謝障礙的遺傳風(fēng)險(xiǎn)人群，采取增加營養(yǎng)素補(bǔ)充、加強(qiáng)紅細(xì)胞葉酸水平監(jiān)測、提高產(chǎn)前篩查和孕期管理依從性等干預(yù)措施，是有效達(dá)到出生缺陷及孕期疾病一級預(yù)防目的的重要方法，也是提高人口素質(zhì)的必要手段。