Y染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(shorttandemrepeat，STR)遺傳標(biāo)記具有分型簡單、易于擴(kuò)增、呈父系遺傳和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在法醫(yī)實(shí)踐中成為分析混合斑、微量降解等生物檢材的個(gè)人識(shí)別和父系男性成員間親權(quán)鑒定的重要手段。核心序列為五核苷酸的Y-STR基因座具有在復(fù)合擴(kuò)增中優(yōu)勢擴(kuò)增少等優(yōu)點(diǎn)，在法醫(yī)實(shí)踐應(yīng)用時(shí)具有一定的優(yōu)勢。目前報(bào)道的五核苷酸Y-STR基因座有十幾個(gè)，相對常用的四核苷酸Y-STR基因座，有關(guān)五核苷酸Y-STR基因座群體資料的研究較少。作者根據(jù)NCBI(http://www.ncbi.com)和有關(guān)報(bào)道，選擇了5個(gè)五核苷酸Y-STR遺傳標(biāo)記:DYS446、DYS447、DYS463、DYS588和DYS643，調(diào)查其在河南漢族群體中的遺傳多態(tài)性，從而為其在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐和人類學(xué)研究中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1材料與方法

1.1樣本來源及處理

知情同意情況下，采集403名河南漢族無關(guān)男性個(gè)體血樣(確定3代以內(nèi)均在河南生活);用常規(guī)有機(jī)酚/氯仿方法提取基因組DNA。

1.2五核苷酸Y-STR基因座基本信息及引物序列

根據(jù)文獻(xiàn)完善5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座的基本遺傳信息。用PrimerPrimierv5.0軟件設(shè)計(jì)引物，用TAMRA和6-FAM兩種熒光染料標(biāo)記引物(表1)，由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.3PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

PCR擴(kuò)增體系為25μL，包含1×TaqDNA聚合酶緩沖液，1.5mmol/LMgCl22.5μL，2mmol/LdNTPs1μL，10μmol/L引物，10～50ngDNA模板，1UTaqPlusDNA聚合酶。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性45s，55～64℃退火45s(表1)，72℃45s，32個(gè)循環(huán);72℃10min;產(chǎn)物于4℃保存。取1μLPCR產(chǎn)物、0.3μL內(nèi)標(biāo)SIZ500和10μL去離子甲酰胺混合均勻，95℃變性后，置ABI3130遺傳分析儀上進(jìn)行全自動(dòng)毛細(xì)管電泳，用GeneMapperIDv3.5軟件對等位基因進(jìn)行分型。

1.4等位基因的分型依據(jù)

1.4.1等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物的制備分別回收5個(gè)基因座經(jīng)60g/L聚丙烯酰胺凝膠電泳后的等位基因片段，放入500μLEP管中，加入50～100μL0.5×TE后混勻過夜，然后取3.0μL作為模板，按1.3所述條件進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物按比例混勻。

1.4.2等位基因的命名分離后的各基因座不同等位基因片段由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司測序，按照國際法醫(yī)遺傳學(xué)學(xué)會(huì)DNA委員會(huì)推薦的命名原則進(jìn)行命名.

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用MicrosoftExcel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。各指標(biāo)計(jì)算公式如下:基因多樣性(genediversity，GD)=n(1-ΣPi2)/(n-1)，Pi為群體中每一種等位基因頻率。單體型多樣性(haplotypediversity，HD)=n(1-ΣPi2)/(n-1)，Pi為群體中每一種單體型的頻率。個(gè)體識(shí)別力(thediscriminationpower，DP)=1-ΣPi2。單體型辨別能力(discriminationcapacity，DC)=n/N，N為樣本數(shù)，n為不同的單體型個(gè)數(shù)。

2結(jié)果

2.1 5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座的測序結(jié)果。DYS446、DYS588和DYS643屬于簡單重復(fù)序列，DYS447和DYS463屬于復(fù)合序列。

2.2 5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座的等位基因頻率及GD、DP值。403名河南漢族個(gè)體中DYS446、DYS447、DYS463、DYS588、DYS643分別出現(xiàn)11、9、7、9和6個(gè)等位基因，其中DYS446和DYS447基因座的多樣性較高，DYS463和DYS643基因座多樣性相對較高，DYS588基因座等位基因分布集中于等位基因13(頻率高達(dá)0.72060)。

2.3 5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座組成的單體型及單體型頻率在河南漢族群體403例無關(guān)男性個(gè)體中，5個(gè)基因座(DYS446、DYS447、DYS463、DYS588和DYS643)組成的單體型有311種，其中261(83.92%)種單體型只出現(xiàn)1次，單體型頻率為0.0025，出現(xiàn)最多的單體型是15-24-22-11-13和15-23-22-12-13，HD、DP和DC分別為0.99793、0.99545和0.77171。

3討論

該研究調(diào)查了5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座在河南漢族群體中的遺傳多態(tài)性，其中DYS446和DYS447的多態(tài)性較高，GD值及DP值均大于0.8;DYS463和DYS643多態(tài)性相對較高;DYS588的GD值和DP值小于0.5，在實(shí)際應(yīng)用中慎用。5個(gè)基因座組成的單體型數(shù)目比DYS463、DYS588和DYS643組成的單體型數(shù)目增加220種，HD值和DP值分別提高到0.99793和0.77171。因此，可以認(rèn)為，DYS446和DYS447基因座對提高5個(gè)基因座的HD和PD發(fā)揮了重要作用。根據(jù)Ballantyne等的報(bào)道:在父系遺傳過程中隨著重復(fù)單位長度的增加，突變率會(huì)相應(yīng)降低，該研究未發(fā)現(xiàn)河南漢族人群中DYS643和DYSYS446基因座存在稀有等位基因11.1和15.1，提示這2個(gè)基因座在河南漢族群體中遺傳相對穩(wěn)定，可重復(fù)性較好。國外有類似報(bào)道，如利用DYS643基因座的優(yōu)勢聯(lián)合其他YSTR基因座進(jìn)行群體研究和將DYS643作為參考基因座進(jìn)行突變率研究等。Promega公司研發(fā)的PowerPlexY23System(PPY23)試劑盒添加了DYS643基因座，并對多個(gè)群體進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)具有較高的法醫(yī)學(xué)應(yīng)用價(jià)值。

因此，DYS446、DYS447和DYS643基因座具有穩(wěn)定性好和多態(tài)性高等優(yōu)勢，可以作為法醫(yī)實(shí)踐中Y-STR遺傳標(biāo)記應(yīng)用的候選基因座。

通過對5個(gè)基因座遺傳多態(tài)性分析，一方面在一定程度上補(bǔ)充了河南漢族群體的Y-STR資料，如與張秀華等[15]的研究比較，發(fā)現(xiàn)在河南漢族群體中存在4個(gè)新的DYS446等位基因，分別是8、19、20和21，其中等位基因8只出現(xiàn)1次，等位基因頻率為0.0025。另一方面也發(fā)現(xiàn)了部分差異，如與胡泊等[16]研究的潮汕漢族群體比較發(fā)現(xiàn)，在河南漢族群體中DYS588出現(xiàn)稀有等位基因6和9;同張永吉等[17]研究的中國朝鮮族進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)了等位基因8、20和21，但并未發(fā)現(xiàn)張永吉等提到的只在漢族群體中出現(xiàn)的等位基因10，因此還需要更多的研究來分析該等位基因在河南漢族群體中是否存在。該研究中，這5個(gè)五核苷酸Y-STR基因座在河南漢族群體中的HD為0.99793，DC達(dá)到0.77171，說明這5個(gè)基因座組成的單體型在河南漢族群體中具有較高的遺傳多態(tài)性。

綜上所述，DYS446、DYS447、DYS463和DYS643在河南漢族群體中具有較好的多態(tài)性，可以應(yīng)用于河南漢族群體法醫(yī)學(xué)實(shí)踐和人類遺傳學(xué)研究。